多元自動化基因組工程

李丹 高海軍

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

多元自動化基因組工程

李丹 高海軍

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

基因組編輯技術(shù)在基因組工程研究中應(yīng)用廣泛，其中位點特異性核酸酶編輯技術(shù)和CRISPR/Cas系統(tǒng)在單基因編輯方面貢獻卓越，但由于基因組的龐大，這些技術(shù)又有一定的局限性。多元自動化基因組工程（MAGE）是一種新型基因組編輯技術(shù)，可同時作用于多個基因，具有快速、高效的特點，已被用于大腸桿菌的基因敲除和基因替換。主要介紹了MAGE的原理、具體操作流程及技術(shù)進展，并結(jié)合MAGE技術(shù)的應(yīng)用，討論其發(fā)展趨勢。

多元自動化基因組工程；基因組編輯技術(shù)；基因組工程；大腸桿菌

多種生物全基因組測序工作已經(jīng)完成，相關(guān)測序結(jié)果已在基礎(chǔ)科學(xué)研究中廣泛應(yīng)用，大量用于基因組工程（genome engineering）研究的新技術(shù)應(yīng)運而生?；蚪M工程是指為了實現(xiàn)某一目標對生物體中特定的基因進行有針對性遺傳修飾的技術(shù)［1］，它開啟了科學(xué)研究新的一頁。基因組工程應(yīng)用廣泛，可被用于敲除或失活一個基因，修復(fù)不利突變［2，3］，或增加生物種群的多樣性，如農(nóng)藥抗性植物技術(shù)的發(fā)展［4，5］，或作為科學(xué)研究的工具如通過觀察基因失活導(dǎo)致的異常現(xiàn)象來闡述該基因的功能。

將一個DNA片段插入活細胞基因組的技術(shù)，如轉(zhuǎn)座子失活技術(shù)，具有一定的隨機性。DNA片段被隨機放置在染色體上，可能會干擾其他基因功能的行使或滅活基因，甚至?xí)斐杀容^嚴重的副作用，如觸發(fā)細胞癌變。更重要的是，這些技術(shù)沒有可重復(fù)性，不能保證同一序列插入不同細胞的同一位置［6，7］。近年來基因組工程研究最大的突破是能夠特定地修飾生物染色體中某一區(qū)域的DNA序列，從而提高基因組修飾的精度，防止細胞毒性的產(chǎn)生，同時也增加了基因組操作的可重復(fù)性。近期發(fā)展起來的基因組編輯技術(shù)（genome editing）很好地詮釋了這一點［8，9］。采用基因組編輯技術(shù)可以對幾乎任意基因進行修飾、編輯。位點特異性核酸酶編輯的技術(shù)［10］以及最近剛興起的由成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas（CRISPR-associa-ted）系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組靶向修飾技術(shù)［11］是其中較重要的兩種。

1 基因組編輯技術(shù)（genome editing）

基因組編輯技術(shù)中用到的位點特異性核酸酶主要包括鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases， ZFN）［12-14］和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）［8，9，15-17］，它們是由序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（鋅指蛋白或轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子）與非特異性DNA切割結(jié)構(gòu)域（Fok I限制性核酸內(nèi)切酶中的非特異性DNA切割結(jié)構(gòu)域）組合而成的人工核酸酶。ZFN和TALEN都能在靶位點切割雙鏈DNA形成DSBs（DNA double-strand break）［18］，引發(fā)細胞內(nèi)的非同源性末端連接修復(fù)，即非同源性末端接合（nonhomologous end joining，NHEJ）［19，20］或同源重組修復(fù)（homology-directed repair，HDR），對基因進行較精確的遺傳修飾。目前已建立了ZFN文庫和TALEN文庫，可從中獲取相關(guān)特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，進行一系列基因改造［21-23］。

由CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組靶向修飾技術(shù)是近期興起的一種基因組定向編輯技術(shù)［11，24］。CRISPR/Cas 系統(tǒng)廣泛分布于細菌和古生菌基因組中，為細胞提供一種獲得性免疫保護機制，即通過一套RNA介導(dǎo)的DNA切割機制使細菌免受外源DNA的侵擾［25-27］。其中II型CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究最為深入，該系統(tǒng)識別外源侵入的短片段DNA分子（即間隔分子）并將其整合到CRISPR基因組內(nèi)，轉(zhuǎn)錄并處理成短的CRISPR RNAs（crRNAs）。這些crRNAs與反式激活的crRNA，即trans-activating rRNA（tracrRNA）結(jié)合，介導(dǎo)DNA的序列特異性切割，最終在Cas蛋白作用下將外源的“致病”DNA分子沉默。

這些基因組編輯技術(shù)在實驗和臨床等方面應(yīng)用廣泛，極大地提高了人們對模式生物的處置和研究能力，也為治療遺傳性疾病、糾正遺傳錯誤提供了一個平臺［2-5，28-33］。

ZFN、TALEN和CRISPR/Cas系統(tǒng)推動整個基因組工程的發(fā)展。由于微生物基因組的規(guī)模十分龐大，單純利用產(chǎn)生DSBs來激活同源重組修復(fù)機制（HDR）或非同源末端連接修復(fù)機制（NHEJ）的方法很難實現(xiàn)多元化，且多處切口同時存在時，會給細胞帶來嚴重的損傷。此外，NHEJ修復(fù)機制在斷裂處也較容易出現(xiàn)微小的基因片段的插入或缺失，導(dǎo)致移碼突變，最終使基因失活。因此迫切需要一種高效的、多元的編輯技術(shù)［19，20］。

2 多元自動化基因組工程（MAGE）

哈佛醫(yī)學(xué)院遺傳系的Church研究小組在2009年8月的Nature雜志上發(fā)表了一項新技術(shù)——多元自動化基因組工程（multiplex automated genome engineering，MAGE）［34］，并于2012年4月申請了美國國家專利［35］。

區(qū)別于一次僅改造一個基因的技術(shù)，多元自動化基因組工程（圖1）可對細胞染色體上的多個基因或位點進行修飾，方式多樣，可以是插入、錯配或缺失，產(chǎn)生多種多樣的基因突變型菌株［34，36］。

2.1 原理

2.1.1 λ噬菌體Red重組系統(tǒng) MAGE基于λ噬菌體Red重組酶的同源重組系統(tǒng)，Red 重組系統(tǒng)由3種蛋白組成：Exo蛋白、Beta蛋白和Gam蛋白。其中Exo蛋白是一種核酸外切酶，結(jié)合在雙鏈DNA末端，從5'端向3'端降解DNA，產(chǎn)生3'突出端；Beta蛋白結(jié)合在單鏈DNA上，介導(dǎo)互補單鏈DNA退火；Gam蛋白可與RecBCD 酶結(jié)合，抑制其對外源DNA的降解。在內(nèi)源性λ重組系統(tǒng)中，控制exo、bet、gam三個基因的PL啟動子受到CI857阻遏蛋白的抑制，CI857阻遏蛋白由cI基因表達產(chǎn)生，是一個溫敏性阻遏子，它在30-34℃條件下，阻遏PL啟動子的功能，使其不能形成λ red蛋白；而在42℃條件下，該阻遏子被抑制，λ red 蛋白正常表達［37-41］。

2.1.2 MAGE基本原理 基于Red重組原理，Church研究小組構(gòu)建了一套科學(xué)、完整的MAGE循環(huán)系統(tǒng)，首先30℃下培養(yǎng)菌體，達到對數(shù)期后溫度變換為42℃，該條件下，CI857阻遏蛋白被抑制，λ-Red蛋白即Exo蛋白、Beta蛋白和Gam蛋白正常表達，接著將菌體冷藏于4℃，防止上述生成的蛋白質(zhì)被降解，同時將人工合成的多個簡并寡核苷酸通過電擊的方式轉(zhuǎn)入細胞中，每個寡核苷酸都靶定了基因組上的一段特定序列，結(jié)合后通過同源重組的方式替換靶定序列。MAGE的的優(yōu)勢在于可重復(fù)進行上述循環(huán)，并能反復(fù)檢測，使更多類的寡核苷酸轉(zhuǎn)入細胞，以促進基因組的快速變異（圖2）［34］。

圖1 多元自動化基因組工程（MAGE）［42］

圖2 MAGE循環(huán)詳細過程［42］

2.2 MAGE自動化裝置

由于上述過程是周期性、循環(huán)式的，操作起來比較繁瑣、費時費力，Church研究小組設(shè)計了一個自動化裝置［34］，使得上述過程實施起來省時省力，更加快速、有效的產(chǎn)生各種組合的基因組。

圖3為詳細的MAGE自動化裝置原理圖，該裝置由3部分組成，分別是可實時監(jiān)控細胞濃度的人工溫控氣候培養(yǎng)箱（綠色）、使細胞在人工培養(yǎng)箱和培養(yǎng)液、緩沖液間交替更換的流控系統(tǒng)（藍色）和實時生產(chǎn)感受態(tài)細胞以便與人工合成的DNA片段庫電轉(zhuǎn)結(jié)合的裝置（黃色）。這3部分相輔相成，使得MAGE循環(huán)重復(fù)、有序進行。

根據(jù)不同的MAGE步驟（生長、熱休克和冷卻），培養(yǎng)基放置于不同溫度條件下的人工培養(yǎng)箱里（30℃、42℃和4℃），此過程中需要注意的是接受了外來DNA片段的感受態(tài)細胞需要通過濾膜過濾并用wash buffer重懸方可進入下一循環(huán)［34］。

2.3 MAGE的優(yōu)勢

MAGE能將大量人工合成的具有各種突變（包括堿基錯配、插入和缺失）的DNA庫導(dǎo)入宿主細胞進行重組，可以快速高效地在全基因組尺度上對菌株的DNA序列進行設(shè)計和修飾，極大地加快了細胞優(yōu)化的進程。它的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在以下幾方面：

圖3 MAGE自動化裝置［34］（顏色標識見電子版）

區(qū)別于以往的技術(shù)，MAGE將ssDNA導(dǎo)入細胞中，這樣使得Red重組效率由導(dǎo)入dsDNA 片段時的0.2%提高到25%［43，44］；MAGE可同時作用于基因組的多個位點。MAGE同時將大量靶向基因組不同部位的序列的ssDNA庫轉(zhuǎn)入細胞中，這樣可產(chǎn)生各種組合的突變型，真正實現(xiàn)了基因組的可編輯、可組裝［34］；MAGE通過上述自動化裝置，重復(fù)周期性的導(dǎo)入ssDNA，快速、高效地得到各種突變型，“一天之內(nèi)可生成數(shù)十億個變化”［1］；導(dǎo)入的ssDNA片段進行磷硫?；蛐揎椧苑乐辜毎旧砗怂嵬馇忻傅慕到?，有研究表明，對外來DNA片段進行硫代磷酸化修飾，重組效率增加了2-3倍［44-46］；導(dǎo)入的ssDNA片段作用于復(fù)制叉的后隨鏈上，研究表明此法比之前作用于前導(dǎo)鏈時重組效率提高了近30倍［43，47］。

2.4 MAGE的應(yīng)用及改進

現(xiàn)在已有成功應(yīng)用MAGE的例子，如大腸桿菌DXP合成途徑改造。隨著其應(yīng)用的推廣，也有一些學(xué)者對該技術(shù)的缺陷和不足進行改進，并成功應(yīng)用到大腸桿菌色氨酸合成等途徑中。

2.4.1 經(jīng)典的大腸桿菌DXP合成途徑改造 番茄紅素合成途徑涉及20個內(nèi)源性基因，包括dxs、 dxr、ispD、ispE、isp、GispH、idi、ispA、appY、rpoS、crl、elbA、elbB、yjiD、purH、rnlA、yggT、ycgZ、ymgA和ariR［48，49］。Church研究小組針對這20個基因進行番茄紅素表達的優(yōu)化，將分別靶定每個基因的ssDNA庫導(dǎo)入細胞中，經(jīng)過35個MAGE循環(huán)，產(chǎn)生了近150億個基因變異體，經(jīng)過合適的篩選方法得到高產(chǎn)番茄紅素突變株。另外，分支途徑上的4個基因（ytjC、fdhF、aceE和gdhA）［50］因引入兩個無義突變而失活，進一步提高了番茄紅素的產(chǎn)量［34］。由于自動化裝置的存在，每個循環(huán)只需2-2.5 h，此工作僅在3 d內(nèi)完成，使得番茄紅素的產(chǎn)量提高了近5倍。由此可見，與之前的單基因操作相比，MAGE可以同時優(yōu)化多個基因，其高效率也得到了證實。

2.4.2 分層次結(jié)合組裝基因組工程（CAGE） 該技術(shù)［51］克服了MAGE僅作用于有限的十幾、二十個位點的缺陷，通過精確的操作，將E. coli 全基因組中314個TAG終止密碼子替換成同義的TAA密碼子。研究人員將314個TAG密碼子分成32個小組，每個小組包含10個TAG-TAA的改變，再分別進行小規(guī)模MAGE重組，然后利用細菌天然結(jié)合能力，獲得更大規(guī)模的換成TAA密碼子的菌株，直到獲得不依賴TAG的全新突變菌株。該技術(shù)使得基因組工程從核苷酸水平上升到了兆堿基水平（the megabase scale）。該技術(shù)也可應(yīng)用于模式微生物操作中，用來生產(chǎn)各種藥品或化學(xué)制品。

2.4.3 共選擇的多元自動化基因組工程（Coselection MAGE） 共選擇的多元自動化基因組工程（CoSMAGE）也是改進MAGE的一種方法，MAGE同時作用于染色體多個位點，可以得到大量的突變株，但篩選過程過于復(fù)雜繁瑣，從而導(dǎo)致大多數(shù)的突變型無法得到鑒定而喪失意義，CoS-MAGE由于co-marks的存在，能更好、更有效的進行突變株的篩選。T7啟動子作為一個co-marks，將其插入與大腸桿菌色氨酸合成途徑（此途徑產(chǎn)生靛藍）相關(guān)的12個基因的上游，經(jīng)過幾輪MAGE后，篩選靛藍產(chǎn)量提高的菌株，然后再進行MAGE，如此幾輪下來產(chǎn)生了80種不同T7啟動子組合，經(jīng)過篩選，得到了一株靛藍產(chǎn)量提高62%的突變株。這說明MAGE可以通過插入co-marks構(gòu)建一個突變基因組合庫來快速有效地篩選到理想菌株［52，53］。

2.4.4 可定位的多重染色體重組技術(shù)（TRMR） 即使如上述添加co-marks來提高篩選效率，仍不能滿足理論存在的突變型篩選工作。上述大腸桿菌色氨酸生物合成過程中，12個基因被工程改造，理論上產(chǎn)生了212種突變型，但事實上研究者們只鑒定出來80種。因此，在大量突變株存在的條件下，一個高通量的篩選方法是很有必要的。2010年，科羅拉多大學(xué)的Warner等［54］發(fā)明了一種可定位的多重染色體重組技術(shù)（trackable multiplex recombineering，TRMR），利用分子條碼［55］、微陣列及MAGE技術(shù)，在一天時間內(nèi)修飾了E. coli內(nèi)95%的基因；在一周內(nèi)，完成影響E. coli生長的近4 000個基因的遺傳定位。具體操作是通過合成帶有分子條碼的，編碼相關(guān)突變的插入序列，電擊轉(zhuǎn)入宿主細胞，然后利用分子條碼技術(shù)追蹤到相關(guān)突變，量化突變率，進行遺傳性狀定位。這樣大大提高了突變株篩選效率，使得MAGE技術(shù)在應(yīng)用中更進一步。

3 結(jié)語

綜上所述，多元自動化基因組工程（MAGE）技術(shù)是一種大幅度修改和進化細胞基因組的技術(shù)，它可將大量人工合成的具有各種突變（包括堿基錯配、插入和缺失）的單鏈DNA庫導(dǎo)入宿主細胞進行重組，快速高效地得到各種突變株。盡管現(xiàn)在已有應(yīng)用MAGE及改進版的MAGE的成功案例，但MAGE有一定的局限性，表現(xiàn)在以下幾點：（1）除2013年有文獻提到一種類似方法應(yīng)用于谷氨酸棒狀桿菌中［56］，MAGE僅用于大腸桿菌這一模式菌株中，可能與其作用機制（如導(dǎo)入的片段作用于后隨鏈）有關(guān)，其廣泛應(yīng)用還有待進一步的探索。（2）經(jīng)過幾輪MAGE，可以產(chǎn)生大量的基因突變型，上述應(yīng)用已提到一些篩選改進方法，但仍未能對大多數(shù)突變型進行篩選，造成多數(shù)突變型的丟失。（3）MAGE突變位點的選擇以及突變序列的設(shè)計對理論儲備和經(jīng)驗提出了更高的要求。（4）MAGE可作用于多個位點，其同源重組效率與單一位點重組相比明顯下降，如何提高這一效率還需更多的研究探索［42］。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Multiplex Automated Genome Engineering

Li Dan Gao Haijun
（School of Life Sciences，Beijing Institute of Technology，Beijing 100081）

Genome editing is widely used in genome engineering research and site-specific nuclease technologies and CRISPR/Cas system focus on single gene editing. Owing to the huge size of genome， there are some limitations on the applications of these technologies. Multiplex Automated Genome Engineering（MAGE）is a new， fast and efficient genome editing technology， which can operate multiple genes simultaneously， and be used in knockout and replacement of Escherichia coli genes. This review illustrates the recent advances in the theory，operation protocol and technological innovation of MAGE， its application and development trend were also discussed.

multiplex automated genome engineering；genome editing；genome engineering；Escherichia coli

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.009

2014-09-22

國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項項目（2012YQ0401400802）

李丹，女，碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：ld_bit@126.com

高海軍，男，博士，副教授，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：hj_gao@aliyun.com