17β-雌二醇對(duì)斑馬魚(yú)性別分化的影響

李國(guó)超 余凱敏 馮為民 劉麗麗 張家禹 閆艷春

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

17β-雌二醇對(duì)斑馬魚(yú)性別分化的影響

李國(guó)超 余凱敏 馮為民 劉麗麗 張家禹 閆艷春

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

有報(bào)道表明，經(jīng)17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）處理后，斑馬魚(yú)種群中雌性比例上升。為了研究E2雌性化作用的機(jī)制，選取一系列斑馬魚(yú)體內(nèi)與性別分化有關(guān)的基因（brca2，sox9a，sox9b，dmrt1和 cyp19a1a），采用qRT-PCR分析它們?cè)诓煌奶幚項(xiàng)l件下表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明，E2能上調(diào)雌性相關(guān)基因（brca2、sox9b）的表達(dá)，下調(diào)部分雄性相關(guān)基因（sox9a）的表達(dá)，對(duì)不同發(fā)育階段的斑馬魚(yú)體內(nèi)的性激素轉(zhuǎn)化通路（cyp19a1a）的影響不同。

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物；17β-雌二醇；斑馬魚(yú)；性別分化

環(huán)境中的多種化合物（包括農(nóng)藥［1］、工業(yè)化學(xué)物［2］和植物激素［3］等）在進(jìn)入生物體內(nèi)后，能干擾正常激素的代謝過(guò)程，從而干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能，對(duì)生物的健康造成危害，這類(lèi)化學(xué)物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為內(nèi)分泌干擾物（Endocrine disrupting chemicals，EDCs），其效應(yīng)以雌激素效應(yīng)為主。在眾多EDCs中，17β-雌二醇（17β-Estrodiol，E2）占主要地位［4，5］，其環(huán)境濃度范圍為0-141 ng/L［6-8］。已有研究從表型上證明E2能促進(jìn)斑馬魚(yú)發(fā)育成雌性［9］。

斑馬魚(yú)屬硬骨魚(yú)類(lèi)，鯉科（Cyprinidae）鮐屬（Danio），是一種小型熱帶淡水魚(yú)。成魚(yú)體長(zhǎng)4-5 cm，3個(gè)月可達(dá)性成熟。斑馬魚(yú)基因與人類(lèi)基因的相似度達(dá)到 87%。作為模式動(dòng)物，斑馬魚(yú)具有繁殖率高、體外受精、遺傳背景清晰等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛用于藥物研發(fā)［10］、人類(lèi)疾病研究［11］和環(huán)境毒理學(xué)［12，13］等領(lǐng)域。其轉(zhuǎn)基因品系也被逐一建立［14］。

與人、小鼠和鳥(niǎo)類(lèi)不同，斑馬魚(yú)的性別不是由XY/XX或ZZ/ZW機(jī)制決定的［15-17］。目前，人們只知道斑馬魚(yú)的性別分化發(fā)生在受精后21 d到42 d（21-42 dpf）［9］，此時(shí)性別分化相關(guān)基因的表達(dá)水平也分別達(dá)到高峰［18］。這些基因包括：乳腺癌易感基因2（brca2）、SRY相關(guān)基因a（sox9a）、SRY相關(guān)基因b（sox9b）、存在于雙性且mab-3相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子1（dmrt1）和細(xì)胞色素P450，家族19，亞家族a，多肽1a（cyp19a1a）。其中與斑馬魚(yú)發(fā)育為雌性相關(guān)的基因是brca2［19，20］、sox9b［21，22］，與發(fā)育為雄性相關(guān)的基因是sox9a［21-23］、dmrt1［18，24-27］，而cyp-19a1a編碼的蛋白可將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，平衡魚(yú)體內(nèi)性激素的比例［21，28，29］。上述基因中，除純合缺失brca2的斑馬魚(yú)會(huì)全部發(fā)育為雄性以外［19，20］，其他基因都不能單獨(dú)決定斑馬魚(yú)的性別。因此推測(cè)斑馬魚(yú)的性別分化是由一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)負(fù)責(zé)調(diào)控的，以上基因都屬于這個(gè)網(wǎng)絡(luò)［16］。

本研究以脊椎動(dòng)物斑馬魚(yú)為材料，采用實(shí)時(shí)定量PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）的方法，從轉(zhuǎn)錄水平對(duì)E2促進(jìn)斑馬魚(yú)發(fā)育成雌性的機(jī)制進(jìn)行探究，填補(bǔ)EDCs影響性別分化機(jī)制的數(shù)據(jù)短缺。為進(jìn)一步探究斑馬魚(yú)的性別決定機(jī)制以及EDCs在其中的影響提供數(shù)據(jù)和線索，也為完善EDCs的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

AB 品系斑馬魚(yú)由北京大學(xué)張博實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.1.1 試劑 17β-雌二醇（17β-Estrodiol，E2）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司（CAS 50-28-2）。

E2暴露實(shí)驗(yàn)A處理液：6 mg E2溶于1 mL無(wú)水乙醇中，再將其溶于1 L培養(yǎng)液（已除氯，pH7.0-7.5，含0.6 g/L NaCl，電導(dǎo)率500 μs/cm），制成6 mg/L E2儲(chǔ)液。用培養(yǎng)液依次將其稀釋成1、2、2.5、3、4、5和6 mg/L的梯度濃度E2溶液。用培養(yǎng)液稀釋無(wú)水乙醇至乙醇終濃度為0.1%，作為對(duì)照組的培養(yǎng)液，即0 mg/L E2溶液。

E2暴露實(shí)驗(yàn)B處理液：1 mg E2溶于1 mL無(wú)水乙醇中，再將其溶于1 L培養(yǎng)液中，制成1 mg/L E2儲(chǔ)液。用培養(yǎng)液和1 L容量瓶將100 mL儲(chǔ)液稀釋10倍，重復(fù)4次得10 ng/L E2溶液。最后用培養(yǎng)液稀釋無(wú)水乙醇至乙醇終濃度為0.000 001%，作為對(duì)照組的培養(yǎng)液，即0 ng/L E2溶液。

總RNA提?。菏褂肨RIzol試劑盒（TaKaRa）。

cDNA的獲得：使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa）。

qRT-PCR：使用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒（TaKaRa）及其PCR體系。

1.1.2 儀器 斑馬魚(yú)獨(dú)立養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛(ài)生）、生化培養(yǎng)箱、液氮罐、-80℃冰箱、顯微鏡（Olympus BX63）、鏈?zhǔn)骄酆厦笖U(kuò)增（PCR）儀（Bio-Rad）、凝膠成像系統(tǒng)（Gene Company Limited）、iQ5 多彩RTPCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚(yú)養(yǎng)殖 使用獨(dú)立養(yǎng)殖設(shè)備（北京愛(ài)生），對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行規(guī)范化的飼養(yǎng)。培養(yǎng)液的電導(dǎo)率為 500-550 μs/cm，pH為 7.0-7.5。魚(yú)房的溫度恒定（27±2℃），光周期恒定（14 h光/10 h暗）。受精后5 d（5 dpf）可喂食草履蟲(chóng)。13 dpf 后，逐漸喂食新鮮豐年蝦，每天喂食2次。根據(jù)斑馬魚(yú)的發(fā)育大小及濃度進(jìn)行適量喂養(yǎng)。

1.2.2 斑馬魚(yú)繁殖 將40條性成熟的斑馬魚(yú)成對(duì)放入孵化盒中（1條雄魚(yú)和1條雌魚(yú)/盒），用隔板分開(kāi)。次日上午抽掉隔板，10 min 后斑馬魚(yú)開(kāi)始產(chǎn)卵，30 min 后進(jìn)行胚胎的收集，放于 28℃的培養(yǎng)箱中。受精后10 h（10 hpf），選擇健康、發(fā)育一致的胚胎，飼養(yǎng)至合適的發(fā)育階段后，可用于E2的暴露實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 雌二醇暴露實(shí)驗(yàn)A 對(duì)于0、1、2、2.5、3、4、5和6 mg/L這個(gè)梯度中的每一個(gè)E2濃度，設(shè)置3個(gè)培養(yǎng)皿作為平行，每個(gè)培養(yǎng)皿中放 50 個(gè)10 hpf胚胎，接受相同濃度的E2處理。每24 h 更換溶液，并及時(shí)去除死卵，處理96 h，分別隨機(jī)收集25條幼魚(yú)，各自作為一個(gè)樣本。用液氮冷凍，-80℃下保存。重復(fù)本實(shí)驗(yàn)3次，每個(gè)E2濃度都得到9個(gè)樣本，每個(gè)樣本含25條幼魚(yú)。

1.2.4 雌二醇暴露實(shí)驗(yàn)B 用0 ng/L和10 ng/L E2分別處理3組平行的10 hpf斑馬魚(yú)胚胎（每組100個(gè)胚胎）。期間，在暴露時(shí)長(zhǎng)為40、50、60、96、9、10和11 d時(shí)，統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)的孵化率、存活率、畸形率。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

用0 ng/L和10 ng/L E2分別處理：3組10 hpf斑馬魚(yú)胚胎（每組50個(gè)胚胎），3組21 dpf的斑馬魚(yú)（每組50條），3組健康成年雄魚(yú)（大于6月齡，每組1條），3組健康成年雌魚(yú)（大于6月齡，每組1條），處理時(shí)長(zhǎng)為9 d。處理完成后，用液氮冷凍并拍攝各組魚(yú)的照片。之后，分別收集各組平行中幼年、青年魚(yú)的全身，并解剖成魚(yú)，獲得卵巢和精巢。將其各自作為一個(gè)樣本，用液氮冷凍，保存在-80℃下。重復(fù)本實(shí)驗(yàn)3次，這樣對(duì)于兩個(gè)濃度的E2溶液處理下的每個(gè)發(fā)育階段，都得到9個(gè)樣本。

1.2.5 qRT-PCR 設(shè)計(jì)每個(gè)性別分化相關(guān)基因和內(nèi)參基因β-actin的引物，送交上海生工公司合成（表1）。經(jīng)PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)知：在退火溫度為57℃時(shí)，能夠獲得清晰的特異性目的條帶。用在E2暴露實(shí)驗(yàn)A和暴露實(shí)驗(yàn)B中獲得的斑馬魚(yú)和性腺，分別提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。采用qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)中的PCR體系。qRT-PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s，40個(gè)循環(huán)（95℃下5 s，57℃下30 s），10℃下20 min。用各基因的引物分別做qRT-PCR。用2-△△CT法分析這些結(jié)果［30］。

表1 qRT-PCR引物

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 用Bartlett檢驗(yàn)和Levene檢驗(yàn)，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化后數(shù)據(jù)的方差齊性。用單因素方差分析和Duncan法多重比較檢驗(yàn)組間差異。所有的統(tǒng)計(jì)分析由SPSS 19.0（美國(guó)SPSS公司）和R［31］兩個(gè)軟件進(jìn)行。除圖3以外，所有圖均用Origin 7.0繪制（美國(guó)Origin實(shí)驗(yàn)室）。

2 結(jié)果

2.1 E2暴露實(shí)驗(yàn)A

以10 hpf為處理起點(diǎn)，設(shè)置一系列E2溶液濃度梯度，分析E2處理96 h后斑馬魚(yú)體內(nèi)性別分化相關(guān)基因的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)4 、5和6 mg/L E2處理96 h后，斑馬魚(yú)胚胎全部死亡并腐爛，無(wú)法收集樣本，因而沒(méi)有繪出其結(jié)果（圖1）。其他濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)E2處理96 h后，brca2的表達(dá)水平隨E2的濃度上升而呈上升趨勢(shì)，最終在3 mg/L E2處理后，其表達(dá)水平呈顯著上調(diào)（P＜0.05）（圖1-A）。sox9b表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與brca2一致，且對(duì)E2更敏感——在2 mg/L E2處理后，其表達(dá)水平已經(jīng)極顯著地上調(diào)（P＜0.01）（圖1-B）。這兩個(gè)雌性相關(guān)基因的表達(dá)水平均對(duì)E2呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性。sox9a和cyp19a1a的表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化，也不受E2溶液濃度變化的影響（圖1-C，D）。在對(duì)照組和處理組中均未檢測(cè)到dmrt1的表達(dá)。

2.2 E2暴露實(shí)驗(yàn)B

在10 ng/L E2處理后，于不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的孵化率、存活率、畸形率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。結(jié)果（圖2）表明，10 ng/L E2不能引起任何肉眼可見(jiàn)的斑馬魚(yú)胚胎的畸形（如體軸彎曲、心包水腫等），不會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)的孵化時(shí)間產(chǎn)生影響（圖2-A）。但如果暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的話，也會(huì)引起幼魚(yú)的死亡（圖2-B）。因此又深入研究了E2處理9 d后，各個(gè)發(fā)育階段的斑馬魚(yú)體內(nèi)性別分化相關(guān)基因的表達(dá)水平的變化。

圖1 經(jīng)不同濃度的雌二醇（E2）溶液處理96 h后，各個(gè)性別分化相關(guān)基因表達(dá)水平的變化

用10 ng/L E2處理不同發(fā)育階段的斑馬魚(yú)，時(shí)長(zhǎng)為9 d。處理后發(fā)現(xiàn)，所有發(fā)育階段的對(duì)照組和處理組斑馬魚(yú)的表型沒(méi)有明顯差異（圖3）。在所有發(fā)育階段的魚(yú)體內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)選擇的全部性別分化相關(guān)基因（即brca2，sox9a，sox9b，dmrt1和 cyp19a1a）的表達(dá)都能被qRT-PCR檢測(cè)到（圖4）。qRT-PCR的結(jié)果表明，經(jīng)10 ng/L E2處理9 d后，幼魚(yú)體內(nèi)所有性別分化相關(guān)基因的表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化（圖4-A、E、I、M、Q）。在21 dpf魚(yú)體內(nèi)，brca2，dmrt1和cyp19a1a的表達(dá)水平顯著上調(diào)。特別是dmrt1，其表達(dá)水平上調(diào)了12倍（P＜0.001）。而sox9b和sox9a的表達(dá)水平無(wú)顯著變化（圖4- B、F、 I、N、R）。在成年雌魚(yú)體內(nèi)，brca2的表達(dá)水平上調(diào)了4倍，而sox9a和cyp19a1a均顯著下調(diào)，sox9b和dmrt1的表達(dá)水平則無(wú)顯著變化（圖4- C、G、K、O、S）。在成年雄魚(yú)體內(nèi)，所有基因的表達(dá)水平均顯著下調(diào)（圖4- D、H、L、P、T）。

3 討論

研究表明，許多環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（如炔雌醇、雙酚A）能促進(jìn)斑馬魚(yú)發(fā)育為雌性，而另一些化合物（如法曲唑）能促進(jìn)斑馬魚(yú)發(fā)育為雄性［32-34］。有報(bào)道用17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）處理幼魚(yú)和21 dpf魚(yú)一段時(shí)間后，將其放回正常的培養(yǎng)液中飼養(yǎng)至成年，會(huì)發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)種群的雌性比例上升，雄魚(yú)的第二性征減弱，部分雄魚(yú)發(fā)育出了卵巢樣的性腺，即E2在表型上促進(jìn)了斑馬魚(yú)發(fā)育為雌性［9］。此外，有研究證明E2同樣能促進(jìn)青鳉發(fā)育為雌性［33-35］。有趣的是，E2對(duì)青鳉體內(nèi)基因表達(dá)水平的影響會(huì)隨溫度和光周期的變化而變化［36］。此外，環(huán)境條件也會(huì)影響斑馬魚(yú)的性別分化。如高水溫和低氧條件能促進(jìn)F1代的雄性比例上升，雌魚(yú)發(fā)育速度變快且進(jìn)行異系繁殖［37-39］。因此推測(cè)，斑馬魚(yú)體內(nèi)可能存在一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)控制其性別的發(fā)育方向，該網(wǎng)絡(luò)會(huì)同時(shí)受到遺傳和環(huán)境因素的影響。而在形態(tài)學(xué)和組織學(xué)水平上已經(jīng)證實(shí)，E2會(huì)促進(jìn)該網(wǎng)絡(luò)推動(dòng)斑馬魚(yú)發(fā)育為雌性［9］。

圖2 經(jīng)10 ng/L E2處理不同時(shí)長(zhǎng)后斑馬魚(yú)的孵化率和存活率

圖3 經(jīng)10 ng/L E2處理9 d后各發(fā)育階段斑馬魚(yú)的表型

本實(shí)驗(yàn)用qRT-PCR的方法，從轉(zhuǎn)錄水平上研究了E2促進(jìn)斑馬魚(yú)發(fā)育為雌性的機(jī)制。我們前期的工作表明，斑馬魚(yú)胚胎的96 h半數(shù)致死濃度在2-3 mg/L這一范圍中（數(shù)據(jù)未給出）。而E2的環(huán)境濃度范圍為0-141 ng/L［6-8］。根據(jù)以上兩點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)E2暴露實(shí)驗(yàn)A和B，分別探究高濃度E2和低濃度E2對(duì)斑馬魚(yú)性別分化相關(guān)基因的表達(dá)水平的影響。

前人研究已證實(shí)brca2的純合缺失突變斑馬魚(yú)會(huì)全部發(fā)育成雄性［19，20］。這表明brca2在斑馬魚(yú)發(fā)育為雌性的過(guò)程中起關(guān)鍵性作用。而sox9b可以被視為斑馬魚(yú)的一個(gè)卵巢標(biāo)志基因［21，22］。E2暴露實(shí)驗(yàn)A的結(jié)果表明，雌二醇能上調(diào)斑馬魚(yú)胚胎中這兩個(gè)雌性相關(guān)基因的表達(dá)，上調(diào)程度呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性。sox9a可以被視為一個(gè)睪丸標(biāo)志基因［21-23］，其表達(dá)水平不受雌二醇影響，dmrt1則沒(méi)有表達(dá)。這表明雌二醇不能影響斑馬魚(yú)胚胎雄性相關(guān)基因的表達(dá)，且雄性相關(guān)基因各自的表達(dá)水平達(dá)到高峰的時(shí)間點(diǎn)并不一致。cyp19a1a的表達(dá)水平不受雌二醇影響，而其編碼的蛋白負(fù)責(zé)將斑馬魚(yú)胚胎體內(nèi)內(nèi)源雄激素轉(zhuǎn)化為內(nèi)源雌激素，從而平衡性激素比例［21，28，29］。說(shuō)明雌二醇不能影響斑馬魚(yú)胚胎體內(nèi)的該通路。

圖4 經(jīng)10 ng/L E2處理9 d后，各發(fā)育階段的斑馬魚(yú)體內(nèi)性別分化相關(guān)基因的表達(dá)水平

E2暴露實(shí)驗(yàn)B的結(jié)果表明，在斑馬魚(yú)胚胎中，10 ng/L E2浸泡9 d的處理不能影響任何一個(gè)性別分化相關(guān)基因的表達(dá)水平（圖4-A、E、I、M、Q）。在21 dpf斑馬魚(yú)（性腺發(fā)育剛剛開(kāi)始）中，該處理上調(diào)了雌性相關(guān)基因的表達(dá)，并促進(jìn)了內(nèi)源雄激素轉(zhuǎn)化為內(nèi)源雌激素（圖4- B、F、I、N、R）。該結(jié)果與前人在形態(tài)學(xué)和組織學(xué)水平上研究得出的結(jié)論一致［9，39］。另外，前人觀察到dmrt1在蛙、龜和鼠的體內(nèi)，都是雄性的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于雌性［25-27］。人們據(jù)此提出假說(shuō)：dmrt1的高表達(dá)水平可能對(duì)于雄性的發(fā)育是必需的，而低表達(dá)水平可能對(duì)于雌性的發(fā)育是必需的［18］。而在本實(shí)驗(yàn)中，在表型上促進(jìn)斑馬魚(yú)發(fā)育為雌性的E2［9，39］，卻能大幅上調(diào)21 dpf魚(yú)體內(nèi)dmrt1的表達(dá)水平（圖4-N）。這說(shuō)明上述假說(shuō)在斑馬魚(yú)體內(nèi)可能是不成立的。即使該假說(shuō)是部分正確的，即dmrt1的上調(diào)表達(dá)確實(shí)能促進(jìn)魚(yú)發(fā)育為雄性，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也證明了dmrt1的效應(yīng)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于brca2（圖4-B、N，dmrt1的上調(diào)倍數(shù)遠(yuǎn)高于brca2，但斑馬魚(yú)依然發(fā)育成雌性）。在成年雌魚(yú)中，E2下調(diào)了部分雄性相關(guān)基因（即sox9a）的表達(dá)水平。同時(shí)，E2還下調(diào)了cyp19a1a的表達(dá)水平，減弱了內(nèi)源雄激素轉(zhuǎn)化為內(nèi)源雌激素的過(guò)程（圖4-K、S）。推測(cè)原因可能是由于魚(yú)吸收了大量外源雌激素E2，導(dǎo)致體內(nèi)的雌激素濃度過(guò)高，以負(fù)反饋機(jī)制抑制了內(nèi)源雌激素的生成。該假設(shè)需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。根據(jù)E2對(duì)成年雌魚(yú)的影響結(jié)果，我們提出了“E2能否引發(fā)成年雄魚(yú)的性逆轉(zhuǎn)”的疑問(wèn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在成年雄魚(yú)中，E2下調(diào)了所有性別分化相關(guān)基因的表達(dá)水平（圖4-D、H、L、P、T）。對(duì)于上述疑問(wèn)：首先，從形態(tài)學(xué)上觀察不到任何性逆轉(zhuǎn)特征（圖3-H）；其次，從轉(zhuǎn)錄水平看不出明顯的性逆轉(zhuǎn)趨勢(shì)（圖4-D、H、L、P、T）；最后，如果需要確切地驗(yàn)證該假說(shuō)，就必須制作性腺切片，從組織學(xué)上加以鑒定。

總之，E2暴露實(shí)驗(yàn)A和暴露實(shí)驗(yàn)B的結(jié)果共同證明，在轉(zhuǎn)錄水平E2能上調(diào)雌性相關(guān)基因（brca2、sox9b）的表達(dá)，下調(diào)部分雄性相關(guān)基因（sox9a）的表達(dá)，該結(jié)果與前人在形態(tài)學(xué)和組織學(xué)水平上研究得出的關(guān)于E2對(duì)魚(yú)類(lèi)性別分化的影響的結(jié)論一致［9，39］，即E2與其他EDCs的效果相同，與法曲唑的效果相反［32-34］。因此，也許可以將“能否促進(jìn)斑馬魚(yú)發(fā)育為雌性”作為評(píng)估某一化合物是否具有雌激素效應(yīng)的一項(xiàng)生理指標(biāo)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用qRT-PCR的方法，從轉(zhuǎn)錄水平研究了雌二醇促進(jìn)斑馬魚(yú)發(fā)育為雌性的機(jī)制。發(fā)現(xiàn)E2能上調(diào)雌性相關(guān)基因（brca2、sox9b）的表達(dá)，下調(diào)部分雄性相關(guān)基因（sox9a）的表達(dá)，對(duì)不同發(fā)育階段的斑馬魚(yú)體內(nèi)性激素轉(zhuǎn)化通路（cyp19a1a）的影響不同。

［1］ Klotz DM， Ladlie BL， Vonier PM， et al. o. p’-DDT and its metabolites inhibit progesterone-dependent responses in yeast ang human cells［J］. Molecular and Cellular Endocrinology， 1997， 129：63-71.

［2］ Ethier SP. Primary culture and serial passage of normal and carcinogen-treated rat mammary epithelial cells in vitro［J］. J NatlCancer Inst， 1985， 74：1307-1318.

［3］ Rudel R. Predicting health effects of exposures to compounds with estrogenic activity：Methodological issues［J］. Environmental Health Perspectives， 1997， 105（Suppl. 3）：665-663.

［4］ Nakada N， Nyunoya H， Nakamura M， et al. Identi fication of estrogenic compounds in wastewater effluent［J］. Envir onmental Toxicology and Chemistry， 2004， 23（12）：2807-2815.

［5］ Snyder SA， Villeneuve DL， Snyder EM， et al. Identification and quantification of estrogen receptor agonists in wastewater Effluents［J］. Environmental Science & Technology， 2001， 35（18）：3620-3625.

［6］ Shore LS， Gurevitz M， Shemesh M. Estrogen as an environmental pollutant［J］. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology， 1993， 51（3）：361.

［7］ Snyder SA， Keith TL， Verbrugge DA， et al. Analytical methods for detection of selected estrogenic compounds in aqueous mixtures［J］. Environmental Science & Technology， 1999， 33（16）：2814-2820.

［8］ Lei B， Huang S， Zhou Y， et al. Levels of six estrogens in water and sediment from three rivers in Tianjin area， China［J］. Chemosphere， 2009， 76（1）：36-42.

［9］ Brion F， Tyler CR， Palazzi X， et al. Impacts of 17β-estradiol，including environmentally relevant concentrations， on reproduction after exposure during embryo-larval-， juvenile- and adult-life stages in zebrafish（Danio rerio）［J］. Aquatic Toxicology， 2004， 68（3）：193-217.

［10］Terriente J， Pujades C. Use of zebrafish embryos for small molecule screening related to cancer［J］. Dev Dyn， 2013， 242（2）：97-107.

［11］Meguro S， Hasumura T， Hase T. Coffee polyphenols exert hypochole sterolemic effects in zebrafish fed a high -cholesterol diet［J］. Nutrition & Metabolism， 2013， 10（1）：61.

［12］Liu L， Xu Y， Xu L， et al. Analysis of differentially expressed proteins in zebrafish（Danio rerio）embryos exposed to chlorpyrifos［J］. Comparative Biochemistry and Physiology Part C：Toxicology & Pharmacology， 2015， 167：183-189.

［13］王健， 劉麗麗， 余凱敏， 等. 高效氯氰菊酯對(duì)斑馬魚(yú)胚胎毒性的研究［J］. 生物技術(shù)通報(bào)， 2014（10）：223-229.

［14］劉麗麗， 王健， 王海勝， 等. 斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)基因平臺(tái)的建立［J］.生物技術(shù)通報(bào)， 2013（10）：120 -126.

［15］ Trant JM， Gavasso S， Ackers J， et al. Developmental expression of cytochrome P450 aromatase genes（cyp19a and cyp19b）in zebrafish fry（Danio rerio）［J］. J Exp Zool， 2001， 290（5）：475-483.

［16］Von Hofsten J， Olsson PE. Zebrafish sex determination and differentiation：involvement of Ftz-F1 genes［J］. Reproductive Biology and Endocrinology， 2005， 3：63-73.

［17］ Wang XG， Bartfai R， Sleptsova-Freidrich I， et al. The timing and extent of ‘juvenile ovary’ phase are highly variable during zebrafish testis differentiation［J］. Journal of Fish Biology， 2007，70（sa）：33-44.

［18］J?rgensen A， Morthorst JE， Andersen O， et al. Expression profiles for six zebrafish genes during gonadal sex differentiation［J］. Reproductive Biology and Endocrinology， 2008， 6（1）：25.

［19］ Shive HR， West RR， Embree LJ， et al. brca2 in zebrafish ovarian development， spermatogenesis， and tumorigenesis［J］. PNAS，2010， 107（45）：19350-19355.

［20］ Rodríguez-Marí A， Wilson C， Titus TA， et al. Roles of brca2（fancd1）in oocyte nuclear architecture， gametogenesis， gonad tumors，and genome stability in zebrafish［J］. PLoS Genetics， 2011， 7（3）：e1001357.

［21］ Rodríguez-Marí A， Yan Y， BreMiller RA， et al. Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone（amh）relative to sox9a， sox9b， and cyp19a1a， during gonad development［J］. Gene Expression Patterns， 2005， 5（5）：655-667.

［22］Tong S， Hsu H， Chung B. Zebrafish monosex population reveals female dominance in sex determination and earliest events of gonad differentiation［J］. Developmental Biology， 2010， 344（2）：849-856.

［23］ Orlando E， Guillette JL. Sexual dimorphic responses in wildlife exposed to endocrine disrupting chemicals［J］. Environmental Research， 2007， 104（1）：163-173.

［24］Guo Y， Cheng H， Huang X， et al. Gene structure， multiple alternative splicing， and expression in gonads of zebrafish Dmrt1［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2005， 330（3）：950-957.

［25］ Raymond CS， Murphy MW， O’sullivan MG， et al. Dmrt1， a gene related to worm and fly sexual regulators， is required for mammalian testis differentiation［J］. Genes & Development， 2000， 14：2587-2595.

［26］Shibata K， Takase M， Nakamura M. The dmrt1 expression in sexreversed gonads of amphibians［J］. General and Comparative Endocrinology， 2002， 127：232-241.

［27］ Torres ML， Landa PA， Moreno MN， et al. Expression profiles of Dax1， Dmrt1， and Sox9 during temperature sex determination in gonads of the sea turtle Lepidochelys olivacea［J］. Gen Comp Endocrinol， 2002， 129（1）：20-26.

［28］ Suzawa M， Ingraham HA. The herbicide atrazine activates endocrine gene networks via non-steroidal NR5A nuclear receptors in fish and mammalian cells［J］. PLoS One， 2008， 3（5）：e2117.

［29］ Trant JM， Gavasso S， Ackers J， et al. Developmental expression of cytochrome P450 aromatase genes（cyp19a and cyp19b）in zebrafish fry（Danio rerio）［J］. J Exp Zool， 2001， 290（5）：475-483.

［30］ Livak KJ， Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod［J］. Methods， 2001， 25（4）：402-408.

［31］ R Core Team. R：A language and environment for statistical computing［CP］. R Foundation for Statistical Computing， Vienna，Austria， 2014. URL http：//www. R-project. org/.

［32］Andersen L， Holbech H， Gessbo A， et al. Effects of exposure to 17a-ethinylestradiol during early development on sexual differentiation and induction of vitellogenin in zebrafish（Danio rerio）［J］. Comparative Biochemistry and Physiology Part C，2003， 134：365-374.

［33］Drastichová J， Svobodová Z， Groenland M， et al. Effect of exposure to bisphenol A and 17β-estradiol on the sex differentiation inzebrafish（Danio rerio）［J］. Acta Veterinaria Brno， 2005， 74：287-291.

［34］Fenske M， Maack G， Schfers C， et al. An environmentally relevant concentration of estrogen induces arrest of male gonad development in zebrafish， Danio rerio［J］. Environmental Toxicology and Chemistry， 2005， 24（5）：1088.

［35］Hirai N， Nanba A， Koshio M， et al. Feminization of Japanese medaka（Oryzias latipes）exposed to 17β-estradiol：Effect of exposure period on spawning performance in sex-transformed females［J］. Aquatic Toxicology， 2006， 79（3）：288-295.

［36］Jin Y， Shu L， Huang F， et al. Environmental cues influence EDC-mediated endocrine disruption effects in different developmental stages of Japanese medaka（Oryzias latipes）［J］. Aquatic Toxicology， 2011， 101（1）：254-260.

［37］ Lawrence C， Ebersole JP， Kesseli RV. Rapid growth and outcrossing promote female development in zebrafish（Danio rerio）［J］. Environmental Biology of Fishes， 2007， 81（2）：239-246.

［38］ Uchida D， Yamashita M， Kitano T， et al. An aromatase inhibitor or high water temperature induce oocyte apoptosis and depletion of P450 aromatase activity in the gonads of genetic female zebrafish during sex-reversal［J］. Comparative Biochemistry and Physiology Part A：Molecular & Integrative Physiology， 2004， 137（1）：11-20.

［39］ Shang EHH， Yu RMK， Wu RSS. Hypoxia affects sex differentiation and development， leading to a male-dominated population in zebrafish（Danio rerio）［J］. Environmental Science & Technology，2006， 40（9）：3118-3122.

（責(zé)任編輯 李楠）

Effects of 17β-estradiol on the Sex Differentiation of Zebrafish（Danio rerio）

Li Guochao Yu Kaimin Feng Weimin Liu Lili Zhang Jiayu Yan Yanchun
（Graduate School，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Previous studies have demonstrated that 17β-estradiol（E2）could increase the female proportion in zebrafish population. In order to study mechanisms of feminization caused by E2， quantitative real-time PCR（qRT-PCR）was used to analyze expression levels of genes involved in sexual differentiation（brca2， sox9a， sox9b， dmrt1 and cyp19a1a）under different conditions. The results indicate that E2 can up-regulate the expression levels of the female-predominant genes（brac2 and sox9b）， partially down-regulate the expression levels of malepredominant gene（sox9a）and has different effects on sex hormone conversion pathway（cyp19a1a）in different developmental stages of zebrafish.

endocrine disrupting chemicals；17β-estradiol；zebrafish；sexual differentiation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.032

2014-11-24

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2008AA10Z402），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31170119），中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院基礎(chǔ)研究基金項(xiàng)目（0042014006，0042012003，0042011006）

李國(guó)超，男，碩士研究生，研究方向：微生物分子生物學(xué)與基因工程；E -mail：stevelee0201@163.com

閆艷春，女，教授，研究方向：微生物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：yanyanchun@caas.cn