• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    犬α干擾素在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及其抗病毒活性的測定

    2015-10-27 01:25:27李皓洋胡小元易詠竹楊鑫張志芳李軼女
    生物技術(shù)通報(bào) 2015年6期
    關(guān)鍵詞:桿狀病毒家蠶干擾素

    李皓洋胡小元易詠竹楊鑫張志芳李軼女

    (1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,北京100081;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所,鎮(zhèn)江 212018)

    犬α干擾素在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及其抗病毒活性的測定

    李皓洋1胡小元1易詠竹2楊鑫1張志芳1李軼女1

    (1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,北京100081;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所,鎮(zhèn)江 212018)

    犬α干擾素(CaIFNα)在犬病防治過程中應(yīng)用廣泛。旨在開發(fā)一種高效的CaIFNα表達(dá)方法。首先按家蠶密碼子的偏好性對GenBank中的一個(gè)CaIFNα基因進(jìn)行了優(yōu)化與合成,將其克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393中,并與親本病毒BmBacmid共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)重組。得到的重組病毒用于感染家蠶幼蟲,收集發(fā)病幼蟲的蠶血淋巴用于CaIFNα檢測。采用細(xì)胞病變抑制法在MDCK-VSV*GFP系統(tǒng)中測定其抗病毒活性。結(jié)果顯示家蠶表達(dá)的CaIFNα能有效抑制VSV*GFP在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制,其抗病毒活性不低于1.78×106U/mL。

    犬α干擾素;家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng);抗病毒活性檢測

    干擾素(Interferon,IFN)是一類具有抗病毒活|性、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化和免疫調(diào)節(jié)作用等多種生理活性的細(xì)胞因子,在自然免疫以及適應(yīng)免疫中都發(fā)揮著重要作用。IFN于1957年由Isasscs等[1]在進(jìn)行流感病毒感染雞胚的實(shí)驗(yàn)中首先發(fā)現(xiàn),隨后逐漸成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。IFN因其抗病毒、抗腫瘤和抗寄生蟲等功效[2-4],一直被當(dāng)作一種廣譜性治療藥物使用。而天然干擾素的含量非常稀少,而且提取純化的成本高昂,極大地制約了其廣泛應(yīng)用。因此,應(yīng)用基因工程手段表達(dá)高活性的干擾素產(chǎn)品,一直以來都是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)問題。

    隨著我國犬飼養(yǎng)量逐年升高,隨之而來的疾病問題也日趨嚴(yán)重??袢?、犬細(xì)小、犬瘟熱等病毒性疾病已經(jīng)成為制約犬飼養(yǎng)業(yè)發(fā)展的主要疾病,并且時(shí)常引起人類感染,嚴(yán)重威脅人類健康和社會安全。CaIFN在多種犬病毒性疾病的防治過程中發(fā)揮了重要作用。CaIFN的研究開始于20世紀(jì)80年代,Himmler等[5]用人IFNα的探針從犬基因組中克隆出了CaIFNα的基因,并利用大腸桿菌對CaIFNα進(jìn)行了原核表達(dá),最后得到了抗病毒活性為3×105U/L的CaIFNα產(chǎn)物。這是對CaIFN研究的首次報(bào)道。1992年Devos等[6]用鼠的IFNγ探針從犬基因組中克隆出了CaIFNγ基因,并成功將CaIFNγ在中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)中進(jìn)行了表達(dá),得到了有抗病毒活性的CaIFNγ產(chǎn)物。之后,人們又利用基因工程手段在多種表達(dá)體系中對犬干擾素進(jìn)行了表達(dá),并且取得了一系列的表達(dá)產(chǎn)品用于犬類疾病的預(yù)防和治療[7,8]。

    CaIFN在多種犬類疾病的預(yù)防和治療過程中都發(fā)揮著重要作用。王紅等[9]給患病毒性腸炎的實(shí)驗(yàn)組病犬注射CaIFNα發(fā)現(xiàn),其發(fā)病癥狀明顯減輕,并且癥狀持續(xù)時(shí)間明顯縮短,說明CaIFNα在犬病毒性腸炎的治愈過程中發(fā)揮了重要作用。王忠海等[10]將CaIFN用作人用狂犬疫苗的佐劑,注射小鼠后發(fā)現(xiàn)CaIFN能誘導(dǎo)中和抗體更早、更多的產(chǎn)生,說明CaIFN在疫苗制備方面有極大的應(yīng)用潛力。與CaIFN的巨大應(yīng)用潛力相比,目前市場中的CaIFN制劑的供應(yīng)量卻略顯不足,一些犬類疾病,如犬過敏性皮膚炎[11]等仍用貓干擾素進(jìn)行治療。因此,簡單、高效、安全的CaIFN表達(dá)方法的研究具有重要價(jià)值。

    CaIFNα是治療犬病毒病的主要藥物,其主要作用原理是通過增加MHCⅠ類分子的表達(dá),從而增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞對其靶細(xì)胞的殺傷作用,同時(shí)增加自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的裂解潛能,使機(jī)體能有效地抵御外源病毒的感染[12]。利用基因工程手段表達(dá)CaIFNα具有可觀的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。本研究將CaIFNα在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá),并在犬細(xì)胞系中檢測其抗病毒活性,以期開發(fā)一種高效的CaIFNα表達(dá)手段。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    大腸桿菌感受態(tài)Trans I由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供。載體構(gòu)建過程中用到的限制性內(nèi)切酶購自Promega公司。昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基(TC-100)購自AppliChem公司。哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基(高糖DMEM),胎牛血清(FBS)購自Gibco公司。CaIFNα基因由南京金斯瑞生物科技有限公司優(yōu)化合成。桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393、犬腎細(xì)胞(MDCK)、家蠶細(xì)胞(Bm-N)、ORF1629缺損的親本桿狀病毒BmBacmid(專利號:201110142492.4)和表達(dá)綠色熒光蛋白的水皰性口炎病毒(VSV *GFP)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2 方法

    1.2.1 CaIFNα基因的優(yōu)化和合成 本研究選取GenBank中的一條CaIFNα基因序列(HQ680864.1),根據(jù)家蠶的密碼子偏好性對基因核苷酸序列進(jìn)行了優(yōu)化改造,在不改變蛋白序列的前提下,優(yōu)化處理了可能影響蛋白表達(dá)與折疊的因素,如GC含量、mRNA的二級結(jié)構(gòu)等,以提高CaIFNα基因在家蠶體內(nèi)的表達(dá)效率。在優(yōu)化好的CaIFNα基因序列起始密碼子前添加了Kozak序列,以提高CaIFNα在真核表達(dá)體系中的表達(dá)效率。此外,為了方便后續(xù)的克隆實(shí)驗(yàn),在CaIFNα的5'末端和3'末端分別添加了的BamHⅠ和XbaⅠ位點(diǎn)。CaIFNα序列由南京金斯瑞公司優(yōu)化合成,并連接到pUC57載體上,形成pUC57-CaIFNα。

    1.2.2 轉(zhuǎn)移載體pVL-CaIFNα的構(gòu)建 將pUC57-CaIFNα進(jìn)行BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切處理,回收目的基因CaIFNα片段。將得到的CaIFNα與同樣用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切處理的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393連接,連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Trans I。挑取單菌落提取質(zhì)粒,并進(jìn)行酶切鑒定,選取含有目的基因的質(zhì)粒送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序,測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致的質(zhì)粒命名為pVL-CaIFNα。

    1.2.3 重組病毒的共轉(zhuǎn)染及篩選 采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pVL-CaIFNα與線性化的親本病毒DNA共轉(zhuǎn)染Bm-N細(xì)胞,使其在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行重組[13]。共轉(zhuǎn)染后將Bm-N細(xì)胞置于27℃環(huán)境中培養(yǎng)6 h,棄上清,補(bǔ)加含10% FBS的TC-100培養(yǎng)基,在27℃環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)觀察約4-5 d,待細(xì)胞病變浮起后,收集上清液,得到重組病毒。將重組病毒液按105pfu/頭的劑量接種五齡起蠶,待家蠶發(fā)病后,收集蠶血淋巴,得到家蠶表達(dá)產(chǎn)物,-20℃保存。

    1.2.4 CaIFNα抗病毒活性的鑒定 采用細(xì)胞病變抑制法[14],利用MDCK-VSV*GFP系統(tǒng)檢測家蠶表達(dá)的CaIFNα的抗病毒活性。樣品以10倍稀釋度做梯度稀釋,共5個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度設(shè)6個(gè)重復(fù)。每個(gè)細(xì)胞孔加入處理后的樣品100 μL,攻毒100TCID50。同時(shí)設(shè)置病毒對照組(只加病毒不加干擾素)和空白對照組(不加病毒和干擾素)。攻毒24 h后,觀察細(xì)胞病變情況,根據(jù)綠色熒光蛋白的表達(dá)量來評估細(xì)胞的病變水平。

    2 結(jié)果

    2.1 合成質(zhì)粒pUC57-CaIFNα的酶切鑒定

    對南京金斯瑞公司優(yōu)化合成的pUC57-CaIFNα質(zhì)粒,進(jìn)行BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定。經(jīng)電泳分離后,出現(xiàn)了一條大小約為600 bp的條帶(圖1)。CaIFNα的基因?yàn)?64 bp,預(yù)期結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。經(jīng)測序分析表明CaIFNα序列合成無誤,可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

    圖1 合成質(zhì)粒pUC57-CaIFNα的酶切鑒定

    2.2 重組轉(zhuǎn)移載體pVL-CaIFNα的酶切鑒定

    目的基因CaIFNα片段與經(jīng)雙酶切pVL1393載體連接后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài),挑取單菌落提取質(zhì)粒后,用BamHⅠ和XbaⅠ對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,經(jīng)電泳分離后,出現(xiàn)于預(yù)期結(jié)果大小相似的目的條帶(圖2)。將含有目的條帶的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序,測序分析表明CaIFNα已正確連接到pVL-1393中。

    圖2 重組轉(zhuǎn)移載體pVL-CaIFNα的酶切鑒定

    2.3 CaIFNα抗病毒活性檢測

    利用細(xì)胞病變抑制法測定表達(dá)的CaIFNα的抗病毒活性,攻毒大約24 h后,觀察到空白對照組細(xì)胞生長狀態(tài)正常,無熒光出現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組加入高濃度干擾素的細(xì)胞孔病毒復(fù)制被完全抑制,無熒光(圖3-A),當(dāng)干擾素稀釋到105倍時(shí),部分細(xì)胞孔出現(xiàn)細(xì)胞病變,但病變程度仍明顯小于病毒對照組,說明該稀釋度下干擾素已無法完全抑制病毒復(fù)制,但仍有明顯的抑制作用(圖3-B),病毒對照組所有細(xì)胞孔都出現(xiàn)熒光(圖3-C)。出現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞孔即記為細(xì)胞病變,記錄細(xì)胞病變情況(表1),統(tǒng)計(jì)病變孔與非病變孔的個(gè)數(shù),按照Reed-Muench法計(jì)算干擾素的效價(jià)。選取多次重復(fù)測定結(jié)果中的較有代表性的一次數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和分析,計(jì)算其效價(jià)至少可達(dá)1.78×106U/mL。

    3 討論

    隨著養(yǎng)犬業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大,犬類疾病對人類健康的影響也越來越嚴(yán)重。CaIFNα作為一種具有廣譜抗病毒、細(xì)菌和寄生蟲活性的生物制劑,在犬類疾病的預(yù)防與治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。CaIFNα的高效表達(dá)一直是生命科學(xué)的一個(gè)研究熱點(diǎn),目前,CaIFNα已在多種表達(dá)體系內(nèi)得到表達(dá)。隨著外源蛋白表達(dá)技術(shù)越來越成熟,如何進(jìn)一步簡化生產(chǎn)工藝,降低生產(chǎn)成本,提高外源蛋白的生物活性將是今后蛋白表達(dá)技術(shù)發(fā)展的方向。

    圖3 利用MDCK/VSV*GFP 系統(tǒng)檢測家蠶表達(dá)的CaIFNα的抗病毒活性

    表1 家蠶表達(dá)的CaIFNα抗病毒活性檢測

    大腸桿菌作為一種傳統(tǒng)的外源蛋白表達(dá)工具,因其遺傳背景清楚、培養(yǎng)周期短、目的基因表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)一直被廣泛使用。殷玉和等[15]合成了編碼CaIFNα的基因片段,在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后利用MDCK-VSV系統(tǒng)進(jìn)行了檢測,測定純化后CaIFNα蛋白的比活為3×107U/mg。畢赤酵母作為一種真核表達(dá)工具,具有翻譯后修飾的功能,能使表達(dá)的外源蛋白正常的進(jìn)行糖基化等修飾,有利于提高外源蛋白的活性,因此也常被用于干擾素的表達(dá)。王玉等[16]將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的CaIFNα基因在畢赤酵母內(nèi)表達(dá),得到最高活性為1.58 × 108U/mg的CaIFNα產(chǎn)品。但外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)常形成包涵體,不具備有效的生物活性,要獲得具有活性的蛋白質(zhì)需要經(jīng)過變性復(fù)性等一系列過程,操作復(fù)雜且成本高昂;在畢赤酵母中的表達(dá)也面臨復(fù)雜的純化過程,這不可避免地增加了干擾素的生產(chǎn)工序和生產(chǎn)成本。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種優(yōu)秀的真核表達(dá)系統(tǒng),具有高安全性,高表達(dá)量和良好的外源蛋白翻譯后加工修飾功能等優(yōu)點(diǎn),在高活性真核蛋白表達(dá)過程中被廣泛采用[17]。故本研究選用家蠶-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來進(jìn)行CaIFNα的表達(dá)。

    由于不同物種中密碼子的使用存在偏好性,因此采用PCR法直接克隆的功能蛋白的DNA序列,在異源宿主體內(nèi)表達(dá)時(shí)經(jīng)常面臨蛋白表達(dá)量低,活性差等一系列問題。密碼子偏好性優(yōu)化是提高異源蛋白表達(dá)量的有效手段[18]。Zhou等[19]在利用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)牛乳頭瘤病毒的衣殼蛋白時(shí),通過密碼子優(yōu)化,使表達(dá)量提高了1 000多倍。因此,本實(shí)驗(yàn)根據(jù)NCBI中的CaIFN-α基因序列,按家蠶密碼子偏好性對其進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí),在優(yōu)化過程中去除了mRNA二級結(jié)構(gòu),重復(fù)序列等不利于蛋白表達(dá)的因素,然后采取化學(xué)合成法合成用于表達(dá)的完整的CaIFNα序列,以期使CaIFNα在家蠶細(xì)胞內(nèi)得到良好表達(dá)。

    在進(jìn)行CaIFNα抗病毒活性測定時(shí),本研究采用了重組VSV*GFP病毒,該病毒感染細(xì)胞后可以在細(xì)胞中復(fù)制,并產(chǎn)生綠色熒光蛋白,通過觀察熒光的有無即可確定細(xì)胞是否被病毒感染[20]。有效避免了用普通VSV測定干擾素活性時(shí)細(xì)胞病變不明顯,觀察結(jié)果偏差大的問題,大大提高了檢測的靈敏度與結(jié)果的可靠性。經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn),測得家蠶表達(dá)的CaIFNα抗病毒活性基本穩(wěn)定,抗病毒活性不低于1.78×106U/mL。

    4 結(jié)論

    本研究對犬α干擾素基因進(jìn)行合理的優(yōu)化設(shè)計(jì),并成功表達(dá)出具有良好抗病毒活性的CaIFNα,每毫升蠶血淋巴中CaIFNα的抗病毒活性不低于1.78×106U,為低成本、高活性的CaIFNα生物制劑的高效制備提供了一種有效途徑。

    [1] Isaacs A, Lindenmann J. Virus interference. I. The interferon[J]. Proc R Soc Lond B Biol Sci, 1957, 147(927):258-267.

    [2] 夏倫斌, 王新華, 連宏軍, 等. γ干擾素及其在動物疾病防控中的應(yīng)用[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2007, 28(5):74-78.

    [3] Nishikawa Y, Iwata A, Nagasawa H, et al. Comparison of the growth inhibitory effects of canine IFN-alpha, -beta and -gamma on canine cells infected with Neospora caninum tachyzoites[J]. J Vet Med Sci, 2001, 63(4):445-448.

    [4] Yasukawa K, Saito S, Kubo T, et al. Low-dose recombinant canine interferon-gamma for treatment of canine atopic dermatitis:an open randomized comparative trial of two doses[J]. Vet Dermatol,2010, 21(1):42-49.

    [5] Himmler A, Hauptmann R, Adolf GR, et al. Structure and expression in Escherichia coli of canine interferon-alpha genes[J]. J Interferon Res, 1987, 7(2):173-183.

    [6] Devos K, Duerinck F, Van Audenhove K, et al. Cloning and expression of the canine interferon-gamma gene[J]. J Interferon Res,1992, 12(2):95-102.

    [7] Zhao N, Yao H, Lan L, et al. Efficient production of canine interferonalpha in silkworm Bombyx mori by use of a BmNPV/Bac-to-Bac expression system[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 78(2):221-226.

    [8] Taira O, Watanugi I, Hagiwara Y, et al. Cloning and expression of canine interferon-alpha genes in Escherichia coli. [J]. J Vet Med Sci, 2005, 67(10):1059-1062.

    [9] 王紅. 犬α-干擾素的表達(dá)及其治療犬病毒性腸炎臨床療效觀察[D]. 北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2009.

    [10] 王忠海. 干擾素在狂犬病疫苗中的佐劑效果研究[J]. 中國藥業(yè), 2009, 18(24):17-19.

    [11] Litzlbauer P, Weber K, Mueller RS. Oral and subcutaneous therapy of canine atopic dermatitis with recombinant feline interferon omega[J]. Cytokine, 2014, 66(1):54-59.

    [12] 鄭拓, 吳長德. 犬干擾素的研究進(jìn)展[J]. 中國獸醫(yī)雜志,2012, 48(1):77-79.

    [13] Li Z, Yi Y, Yin X, et al. Expression of foot-and-mouth disease virus capsid proteins in silkworm-baculovirus expression system and its utilization as a subunit vaccine[J]. PLoS One, 2008, 3(5):e2273.

    [14] 李田田, 楊靈, 易詠竹, 等. 雞α干擾素在家蠶中的表達(dá)及抗病毒活性測定[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2014(3):171-176.

    [15] 殷玉和, 李瑩瑩, 劉新濤, 等. 犬α干擾素的原核表達(dá)及活性檢測[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2013, 44(7):69-72.

    [16] 王玉, 朱艷平, 郭霄峰. 犬干擾素α1基因的修飾及在畢赤酵母中的表達(dá)[J]. 中國生物制品學(xué)雜志:, 2011, 24(9):1064-1067.

    [17] Usami A, Suzuki T, Nagaya H, et al. Silkworm as a host of baculovirus expression[J]. Curr Pharm Biotechnol, 2010, 11(3):246-250.

    [18] Gustafsson C, Govindarajan S, Minshull J. Codon bias and heterologous protein expression[J]. Trends Biotechnol, 2004, 22(7):346-353.

    [19] Zhou J, Liu W, Peng S, et al. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability[J]. J Virol, 1999, 73(6):4972-4982.

    [20] 溫志遠(yuǎn), 葛金英, 胡森, 等. 表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白重組水皰性口炎病毒印第安納株的構(gòu)建[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2007, 29(12):905-911.

    (責(zé)任編輯 李楠)

    Expression of Canine Interferon Alpha in Silkworm-baculovirus Expression System and the Antiviral Activity Assay

    Li Haoyang1Hu Xiaoyuan1Yi Yongzhu2Yang Xin1Zhang Zhifang1Li Yinü1
    (1. Biotechnology Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081;2. The Sericultural Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Zhenjiang 212018)

    Canine interferon alpha(CaIFNα)was widely used in the prophylaxis and cure of canine diseases. The purpose of this study is to develop an efficient method to express CaIFNα. A canine interferon alpha gene in GenBank was optimized according to the codon bias of silkworm and synthesized, and then cloned into the baculovirus transfer vector pVL1393 to construct the recombinant plasmid pVL-CaIFNα. The pVL-CaIFNα was co-transfected with the BmBacmid DNA into silkworm cells and after in vivo recombination. The recombinant virus was gathered and used to infect silkworm larvae. The hemolymph of infected larvae was collected for antiviral activity assay. The antiviral activity of expressed CaIFNα was examined on Madin-Darby canine kidney cells infected with the vesicular stomatitis virus expressing green fluorescent protein(VSV*GFP). The result showed that CaIFNα expressed in silkworm can inhibit the multiplication of VSV*GFP and the antiviral activity was about 1.78×106U/mL.

    canine interferon alpha;silkworm-baculovirus expression system;antiviral activity assay

    10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.022

    2015-03-17

    國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863”計(jì)劃(2011AA100603),國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃“973”計(jì)劃(2012CB114600)

    李皓洋,男,碩士,研究方向:昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng);E-mail:815579279@qq.com

    李軼女,女,博士,副研究員,研究方向桿:桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng);E-mail:liyinv@caas.cn

    猜你喜歡
    桿狀病毒家蠶干擾素
    桿狀病毒載體滅活方法的研究進(jìn)展
    家蠶原原種“871”“872”種性變化分析
    南美白對蝦白斑綜合癥桿狀病毒病(WSSV)的危害及預(yù)防措施
    抗BmNPV家蠶新品種“川抗1號”的育成
    家蠶猝倒病的發(fā)生與防治
    《豬流行性腹瀉病毒N蛋白桿狀病毒表達(dá)與間接ELISA方法建立》圖版
    凡納濱對蝦對蝦桿狀病毒PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用
    α-干擾素聯(lián)合利巴韋林治療慢性丙型肝炎
    浙江省1973年引進(jìn)家蠶品種名
    霧化吸入γ干擾素對免疫低下肺炎的療效觀察
    可以免费在线观看a视频的电影网站| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 精品国内亚洲2022精品成人 | 黑丝袜美女国产一区| www.自偷自拍.com| 国产精品久久久久成人av| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产福利在线免费观看视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产精品国产三级国产专区5o| 日本av手机在线免费观看| 男女边摸边吃奶| 99国产精品免费福利视频| 激情视频va一区二区三区| 91精品国产国语对白视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产黄色免费在线视频| 亚洲久久久国产精品| 久久狼人影院| 亚洲精品第二区| 丁香六月欧美| 国产男人的电影天堂91| 精品国产乱码久久久久久小说| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品偷伦视频观看了| 叶爱在线成人免费视频播放| 另类亚洲欧美激情| 欧美+亚洲+日韩+国产| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 久久综合国产亚洲精品| 老司机福利观看| 欧美精品一区二区免费开放| 最近最新中文字幕大全免费视频| 一二三四社区在线视频社区8| 日本欧美视频一区| 亚洲全国av大片| 国产精品免费视频内射| 黄色毛片三级朝国网站| 免费av中文字幕在线| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲人成电影观看| 日本a在线网址| 欧美黑人欧美精品刺激| 18禁观看日本| 亚洲国产精品成人久久小说| 日本av手机在线免费观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产黄频视频在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 精品乱码久久久久久99久播| 极品少妇高潮喷水抽搐| 丝袜美足系列| 一级片'在线观看视频| 国产国语露脸激情在线看| 日韩大码丰满熟妇| 欧美激情高清一区二区三区| 99国产精品免费福利视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 婷婷成人精品国产| 欧美激情久久久久久爽电影 | 国产在线一区二区三区精| 岛国在线观看网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美久久黑人一区二区| 一本久久精品| √禁漫天堂资源中文www| 美女主播在线视频| 天堂中文最新版在线下载| 久久中文看片网| 午夜影院在线不卡| 老司机靠b影院| 岛国在线观看网站| 亚洲成人手机| 久久热在线av| 少妇人妻久久综合中文| 大香蕉久久成人网| 99国产精品一区二区蜜桃av | 日韩大片免费观看网站| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 性色av乱码一区二区三区2| 国产欧美日韩精品亚洲av| 一区二区日韩欧美中文字幕| 久久精品国产a三级三级三级| 国产视频一区二区在线看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 一级毛片精品| 色综合欧美亚洲国产小说| 操美女的视频在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| av福利片在线| 久久精品亚洲av国产电影网| 最新的欧美精品一区二区| 中亚洲国语对白在线视频| 黄色片一级片一级黄色片| 免费不卡黄色视频| 大香蕉久久成人网| 久久久久国内视频| 亚洲av日韩在线播放| 丝袜美腿诱惑在线| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产欧美日韩精品亚洲av| 91精品三级在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 午夜福利视频在线观看免费| 嫩草影视91久久| 嫩草影视91久久| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 999久久久精品免费观看国产| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产一级毛片在线| 99热全是精品| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲国产欧美网| 脱女人内裤的视频| 欧美久久黑人一区二区| av天堂久久9| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 老司机午夜福利在线观看视频 | 少妇精品久久久久久久| 不卡一级毛片| 亚洲熟女毛片儿| 高清欧美精品videossex| 两个人看的免费小视频| 人妻久久中文字幕网| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久九九热精品免费| 一级片免费观看大全| 电影成人av| 51午夜福利影视在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 午夜免费成人在线视频| 亚洲伊人色综图| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 午夜福利视频精品| 亚洲情色 制服丝袜| 99热网站在线观看| 少妇人妻久久综合中文| 国产欧美日韩一区二区精品| 一区二区三区精品91| 日本a在线网址| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | av天堂在线播放| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产精品免费视频内射| 欧美激情久久久久久爽电影 | 国产在线免费精品| 热99久久久久精品小说推荐| 青春草视频在线免费观看| avwww免费| 美女午夜性视频免费| 美女午夜性视频免费| 人妻 亚洲 视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 在线观看一区二区三区激情| 精品亚洲成a人片在线观看| tube8黄色片| 成年动漫av网址| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 性高湖久久久久久久久免费观看| www.av在线官网国产| 天天添夜夜摸| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 黄色视频,在线免费观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 精品福利观看| 久久人人爽人人片av| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 无遮挡黄片免费观看| 精品人妻在线不人妻| kizo精华| 成年人免费黄色播放视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 成人手机av| 大码成人一级视频| av网站在线播放免费| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 精品乱码久久久久久99久播| 老汉色av国产亚洲站长工具| 一个人免费在线观看的高清视频 | 极品人妻少妇av视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 精品一区在线观看国产| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 久久久久国产一级毛片高清牌| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品免费大片| 黑人猛操日本美女一级片| 91老司机精品| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 十八禁高潮呻吟视频| 欧美97在线视频| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲中文av在线| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 丝袜人妻中文字幕| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 欧美一级毛片孕妇| 2018国产大陆天天弄谢| 国产成人av教育| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| av免费在线观看网站| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲第一青青草原| 老司机影院毛片| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久性视频一级片| 国产麻豆69| 国产精品欧美亚洲77777| 脱女人内裤的视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 水蜜桃什么品种好| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 嫩草影视91久久| h视频一区二区三区| 国产欧美亚洲国产| 日韩欧美免费精品| 又大又爽又粗| bbb黄色大片| 国产片内射在线| 99九九在线精品视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产日韩欧美视频二区| 自线自在国产av| 一区二区三区精品91| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲欧美一区二区三区久久| av免费在线观看网站| 精品亚洲成国产av| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 精品视频人人做人人爽| 欧美日本中文国产一区发布| 久久精品国产亚洲av高清一级| 成人手机av| 狂野欧美激情性xxxx| 搡老乐熟女国产| 亚洲精品国产av成人精品| 动漫黄色视频在线观看| tube8黄色片| 日本黄色日本黄色录像| 麻豆av在线久日| 国产97色在线日韩免费| 久久久久久久精品精品| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 韩国精品一区二区三区| 人妻一区二区av| cao死你这个sao货| 99热网站在线观看| 一级毛片女人18水好多| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 97在线人人人人妻| 高清视频免费观看一区二区| 男女之事视频高清在线观看| av福利片在线| 制服人妻中文乱码| 色老头精品视频在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 18在线观看网站| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久久青草综合色| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲精品一区蜜桃| 岛国毛片在线播放| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲综合色网址| 热re99久久国产66热| 久久精品国产a三级三级三级| 久久人妻熟女aⅴ| 女警被强在线播放| 丰满迷人的少妇在线观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 新久久久久国产一级毛片| 国产在线视频一区二区| 免费看十八禁软件| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美人与性动交α欧美软件| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产精品 国内视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 一区二区三区乱码不卡18| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 母亲3免费完整高清在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲国产欧美网| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 99精品欧美一区二区三区四区| 男女边摸边吃奶| 美女扒开内裤让男人捅视频| 高清欧美精品videossex| 乱人伦中国视频| 91精品三级在线观看| 国产黄频视频在线观看| 久久ye,这里只有精品| 97人妻天天添夜夜摸| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 一级毛片女人18水好多| 欧美日韩精品网址| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 精品国产一区二区久久| 国产免费视频播放在线视频| 成人av一区二区三区在线看 | svipshipincom国产片| 国产成+人综合+亚洲专区| 乱人伦中国视频| 久久久国产精品麻豆| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久ye,这里只有精品| 九色亚洲精品在线播放| 午夜福利乱码中文字幕| 国产成人精品久久二区二区91| e午夜精品久久久久久久| 久久 成人 亚洲| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲国产看品久久| 久久精品国产亚洲av高清一级| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲欧美清纯卡通| 99久久人妻综合| 女人久久www免费人成看片| 成人黄色视频免费在线看| www.熟女人妻精品国产| 在线观看www视频免费| 亚洲男人天堂网一区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 午夜福利影视在线免费观看| 免费黄频网站在线观看国产| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲国产欧美在线一区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲av电影在线进入| 夜夜夜夜夜久久久久| 一本大道久久a久久精品| 在线观看一区二区三区激情| 在线看a的网站| 国产成人啪精品午夜网站| 老司机在亚洲福利影院| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 最近最新免费中文字幕在线| 精品一区在线观看国产| 欧美成人午夜精品| 欧美黄色片欧美黄色片| 两性夫妻黄色片| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲全国av大片| 俄罗斯特黄特色一大片| 首页视频小说图片口味搜索| 9热在线视频观看99| 考比视频在线观看| 桃红色精品国产亚洲av| 久久影院123| 亚洲三区欧美一区| 欧美黑人欧美精品刺激| 一进一出抽搐动态| 欧美乱码精品一区二区三区| av在线app专区| 成年美女黄网站色视频大全免费| 人妻久久中文字幕网| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 免费在线观看完整版高清| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 天天操日日干夜夜撸| 欧美国产精品一级二级三级| 欧美成人午夜精品| 亚洲久久久国产精品| 女警被强在线播放| netflix在线观看网站| 国产在线观看jvid| 在线看a的网站| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| a 毛片基地| 免费在线观看完整版高清| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 9191精品国产免费久久| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 日韩人妻精品一区2区三区| 搡老乐熟女国产| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产三级黄色录像| 性少妇av在线| 不卡av一区二区三区| 国产精品国产av在线观看| 后天国语完整版免费观看| 国产成人a∨麻豆精品| 一个人免费看片子| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 99九九在线精品视频| 亚洲视频免费观看视频| 桃花免费在线播放| 欧美人与性动交α欧美软件| 久热这里只有精品99| 十八禁人妻一区二区| 黄色毛片三级朝国网站| 一个人免费看片子| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 嫁个100分男人电影在线观看| 久久青草综合色| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲国产看品久久| 超色免费av| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产淫语在线视频| 一区二区三区精品91| 亚洲av成人一区二区三| 免费少妇av软件| 亚洲熟女精品中文字幕| 午夜福利影视在线免费观看| 国产av一区二区精品久久| 午夜精品久久久久久毛片777| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产精品国产av在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 9191精品国产免费久久| 人妻 亚洲 视频| 99香蕉大伊视频| 人妻人人澡人人爽人人| 欧美午夜高清在线| 午夜老司机福利片| 国产精品久久久久久精品电影小说| 午夜福利,免费看| 99热网站在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 午夜福利免费观看在线| www.精华液| 飞空精品影院首页| 久久精品国产亚洲av高清一级| 中文字幕最新亚洲高清| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 午夜福利视频精品| 精品一区二区三卡| 男人操女人黄网站| 在线 av 中文字幕| 国产欧美日韩一区二区三 | 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲视频免费观看视频| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产三级黄色录像| √禁漫天堂资源中文www| 91字幕亚洲| 久久久久国内视频| 亚洲欧美清纯卡通| 国产精品二区激情视频| 中文字幕色久视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 69av精品久久久久久 | 亚洲精品av麻豆狂野| 国产又爽黄色视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 男人爽女人下面视频在线观看| 女人久久www免费人成看片| 正在播放国产对白刺激| av在线app专区| 69精品国产乱码久久久| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 午夜老司机福利片| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 丝袜美腿诱惑在线| 少妇人妻久久综合中文| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 一二三四社区在线视频社区8| av网站免费在线观看视频| 欧美另类一区| 18禁观看日本| 日韩人妻精品一区2区三区| 9191精品国产免费久久| 国产91精品成人一区二区三区 | av福利片在线| 水蜜桃什么品种好| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 男女午夜视频在线观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美黄色淫秽网站| 午夜两性在线视频| 在线看a的网站| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产91精品成人一区二区三区 | e午夜精品久久久久久久| 国产亚洲一区二区精品| 99国产精品一区二区蜜桃av | 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 亚洲avbb在线观看| 99久久人妻综合| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产精品一区二区精品视频观看| 日韩视频一区二区在线观看| 国产成人av激情在线播放| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产区一区二久久| 不卡一级毛片| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 后天国语完整版免费观看| 一级黄色大片毛片| 日本a在线网址| 久久精品国产综合久久久| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产精品一区二区在线不卡| 国产xxxxx性猛交| 十分钟在线观看高清视频www| 欧美 日韩 精品 国产| 十八禁人妻一区二区| 丝袜脚勾引网站| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲情色 制服丝袜| 在线永久观看黄色视频| 老司机午夜福利在线观看视频 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产真人三级小视频在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 老司机深夜福利视频在线观看 | 亚洲精品久久午夜乱码| 人妻 亚洲 视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 99久久国产精品久久久| 悠悠久久av| 后天国语完整版免费观看| 一区二区三区激情视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 99国产精品一区二区三区| 香蕉丝袜av| xxxhd国产人妻xxx| 精品乱码久久久久久99久播| 欧美少妇被猛烈插入视频| 在线观看免费视频网站a站| 最新在线观看一区二区三区| 97在线人人人人妻| 日本wwww免费看| 欧美 日韩 精品 国产| 久久精品成人免费网站| a 毛片基地| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 一区二区三区精品91| 亚洲三区欧美一区| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲精华国产精华精| 97人妻天天添夜夜摸| 永久免费av网站大全| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 桃花免费在线播放| 新久久久久国产一级毛片| 99久久精品国产亚洲精品| videos熟女内射| 少妇的丰满在线观看| 亚洲全国av大片| 午夜老司机福利片| 成人国产一区最新在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产成人欧美| 99热国产这里只有精品6| 成人国产一区最新在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲少妇的诱惑av| 日韩大片免费观看网站| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 婷婷丁香在线五月| 国产真人三级小视频在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 日韩精品免费视频一区二区三区| 大片电影免费在线观看免费| 一区福利在线观看| 正在播放国产对白刺激| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲 欧美一区二区三区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲国产欧美网| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 9热在线视频观看99| 这个男人来自地球电影免费观看| 在线观看www视频免费| 99香蕉大伊视频| 日本五十路高清| 国产男人的电影天堂91| 两个人免费观看高清视频|