候選抑癌基因RASSF6在胃癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

劉新蘭，李淑璟，張海霞

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)研究生院，銀川 750004）

腫瘤的形成是多基因病變的過程，其發(fā)生發(fā)展與抑制細(xì)胞突變和異常增殖的抑癌基因功能失活密切相關(guān)。RASSF6近年來在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)和證實(shí)是潛在的抑癌基因，但在胃癌中罕見報(bào)道。本研究應(yīng)用組織微陣列通過免疫組化SP法、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western blot法檢測(cè)候選抑癌基因RASSF6在胃癌組織中的表達(dá)情況，分析它們與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，探討RASSF6是否為胃癌的抑癌基因。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源及處理 選取在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院手術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)的胃癌及癌旁正常組織標(biāo)本各100例，其中80份為2010年1月-2013年3月的胃癌及癌旁正常組織石蠟標(biāo)本，20份為2013年4月-6月新鮮胃癌及癌旁正常組織標(biāo)本，新鮮標(biāo)本以無菌手術(shù)器械剪取癌組織和距癌灶5 cm的癌旁組織，所有標(biāo)本切取后分為2份，一份放入經(jīng)0.1%DEPC（焦磷酸酯）水處理過的凍存管內(nèi)，置-80℃冰箱凍存；另一份經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定常規(guī)石蠟包埋、切片。所有患者術(shù)前未接受任何放、化療等抗腫瘤治療。男性67例，女性33例；年齡：<60歲35例，≥60歲65例；腫瘤大?。?3 cm的38例，≥3 cm的62例；漢族61例，少數(shù)民族39例；分化程度：高分化19例，中分化24例，低分化57例；浸潤(rùn)深度：黏膜及黏膜下22例，肌層23例，漿膜及漿膜外55例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者53例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者47例；TNM分期按照2010年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）公布的標(biāo)準(zhǔn)：…期32例，…期14例，Ⅲ期46例，…期8例。

1.2 組織微陣列技術(shù)免疫組化SP法 兔抗人RASSF6多克隆抗體1∶200稀釋，購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，DAB等試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，制備孔徑為3mm的含有52個(gè)組織芯的組織芯片，連續(xù)制成4μm厚切片若干張，進(jìn)行SP法免疫組化染色。每例標(biāo)本選4張切片，1張用于HE染色，其余3張用于IHC染色，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件。用已知陽性的肝癌組織切片作為陽性對(duì)照，PBS作為陰性對(duì)照。結(jié)果依照Fromowitz綜合計(jì)分法，將細(xì)胞著色強(qiáng)度與陽性著色細(xì)胞所占百分比二者結(jié)合判定，細(xì)胞著色強(qiáng)度：不著色計(jì)0分；淡黃色計(jì)1分；棕黃色計(jì)2分；棕褐色計(jì)3分。二者積分相加：0～1分為陰性，≥2分為陽性。陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為10個(gè)視野陽性細(xì)胞的平均數(shù)占這10個(gè)視野中細(xì)胞數(shù)的百分比：<5%計(jì)0分；5%～25%計(jì)1分；26%～50%計(jì) 2分；51%～75%計(jì)3分；>75%計(jì)4分。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 提取新鮮胃癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后擴(kuò)增和分析。采用β-actin為內(nèi)參照,RASSF6和β-actin RNA引物序列由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，RASSF6上、下游引物分別為：5c-AGCTGCCAGTTCTTGGAATG-3c、5c-AGGCCAGAC AGCTCTGATGT-3c；β-actin上、下游引物分別為：5c-CCACGGCTGCTTCCAGCTCC-3c，5c-GGACTCC ATGCCCAGGAAGGAA-3c。反應(yīng)條件為25μL的反應(yīng)體系，94℃預(yù)變性 3min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min，至4℃終止。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用2-△△Ct進(jìn)行處理。

1.4 Western blot液氮中取出組織后裂解液裂解，同時(shí)加蛋白酶及磷酸酶抑制劑，BCA法測(cè)蛋白濃度，100℃5min變性蛋白，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜25V30min，以含5%脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉1 h，加RASSF6一抗（1∶500）、內(nèi)參照 GAPDH 一抗（1∶1 000），4 ℃過夜；二抗（1∶5 000）室溫 1 h，顯影后凝膠成像系統(tǒng)掃描，并用圖像分析軟件進(jìn)行定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以x±s表示，采用t檢驗(yàn)，Spearman相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織微陣列技術(shù)免疫組化SP法

2.1.1 RASSF6的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

胃癌組織中RASSF6的表達(dá)在分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胃癌臨床分期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表 1。

表1 RASSF6的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系Tab1 Expressionsof RASSF6 in gastric cancer and itsassociation with clinicopathologic feature

2.1.2 胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中RASSF6的表達(dá) RASSF6陽性染色主要定位于胃癌細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞核，呈深棕色顆粒狀（圖1），100例胃癌組織中RASSF6陽性表達(dá)率為31.0%，明顯低于癌旁正常胃黏膜組織中的陽性表達(dá)率76.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

圖1 胃癌組織中RASSF6的表達(dá)(SP×200)Fig 1 Expressionsof RASSF6 in gastric cancer(SP×200)

圖2 正常胃黏膜中RASSF6的表達(dá)(SP×200)Fig 2 Expressionsof RASSF6 in adjacentnorm al tissues(SP×200)

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法 20例胃癌組織中RASSF6mRNA的表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 RASSF6mRNA在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)Tab 2 Expressionsof RASSF6mRNA levels in thegastric cancers and theadjacentnorm al tissues

2.3 Western blot法 20例胃癌組織中RASSF6蛋白的表達(dá)量為1.589±2.237，明顯低于癌旁正常胃組織中的表達(dá)5.723±1.939，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 3、圖 4。

圖3 GAPDH在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)（T為胃癌組織、N為正常組織）Fig3 ExpressionsofGAPDH in thegastric cancersand theadjacent norm al tissues

圖4 RASSF6在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)（T為胃癌組織、N為正常組織）Fig 4 ExpressionsofRASSF6 in thegastric cancersand theadjacent normal tissues

3 討論

胃癌仍是全球范圍內(nèi)因癌死亡的第二位原因[1]，在我國(guó)其發(fā)病率和死亡率也居各種消化系統(tǒng)惡性腫瘤之首。主要原因是臨床上診斷分析缺乏特異的腫瘤標(biāo)志物，早期診斷率低。因此尋找與胃癌早期診斷和治療相關(guān)的新的基因已成為目前胃癌研究的重點(diǎn)內(nèi)容。近年來有學(xué)者認(rèn)為RASSF6基因可能是胃癌新的候選抑癌基因，其在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用值得深入研究。

RASSF6是Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族（RASSFs）新成員之一，位于染色體4q13.3，含13個(gè)外顯子，有3個(gè)轉(zhuǎn)錄本（RASSF6A～RASSF6C）[2-3]，該家族是 2000 年由Dammann等[4]首次發(fā)現(xiàn)并命名，參與不同的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制如凋亡、細(xì)胞周期控制、微管穩(wěn)定性等，一些還表現(xiàn)出抑制腫瘤的功能[2,5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)RASSF6可在HeLa、MCF-7和HepG2等細(xì)胞株中檢測(cè)到，但在原發(fā)性乳腺癌、甲狀腺癌組織中表達(dá)減少[7-9]，因此推測(cè)RASSF6可能在腫瘤形成中起作用[8-9]。

本研究采用組織微陣列技術(shù)，通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)RASSF6在100例胃癌組織及癌旁正常胃組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RASSF6在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為31.0%，明顯低于其在正常胃組織中的表達(dá)（76.0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了進(jìn)一步證實(shí)RASSF6在胃癌中的表達(dá)差異，筆者又通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)了20例新鮮胃癌及癌旁正常胃黏膜組織中RASSF6 mRNA及蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中RASSF6mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯低于癌旁正常胃組織，這與免疫組化結(jié)果相一致。因此推測(cè)RASSF6可能是胃癌中新的抑癌基因，其表達(dá)缺失可能導(dǎo)致腫瘤更易向惡性表型發(fā)展。經(jīng)過上述的驗(yàn)證后筆者又對(duì)RASSF6蛋白陽性表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行了分析，其結(jié)果顯示，RASSF6表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤大小及民族無關(guān)，這與文獻(xiàn)報(bào)道[7，10]相一致。提示RASSF6在胃癌的發(fā)生、進(jìn)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了負(fù)性調(diào)控的作用。

綜上，RASSF6在胃癌中可能為新的抑癌基因。其表達(dá)缺失可促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展，也可致腫瘤更易向惡性表型發(fā)展。在胃癌早期進(jìn)行RASSF6失表達(dá)的檢測(cè)，可能為胃癌的早期篩查和診斷提供有利的生物學(xué)信息。雖然RASSF6的具體作用機(jī)制目前尚不明確，但相信隨著對(duì)RASSF6基因的深入研究，會(huì)對(duì)其在腫瘤中的作用有一個(gè)更全面的認(rèn)識(shí)。

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