新烷化劑替莫唑胺酯對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的影響

郭珊珊，朱仲玲，徐 輝，丁鳳霞，王國成，趙 敏，閻 昭

（1.天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，國家藥物臨床試驗機(jī)構(gòu)，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗室，天津 300060；2.天津天士力集團(tuán)研究院，天津 300402）

多形性腦膠質(zhì)瘤（GBM）是惡性程度最高的原發(fā)性腦腫瘤[1]。目前，術(shù)后替莫唑胺（TMZ）聯(lián)合放療是治療GBM的標(biāo)準(zhǔn)方案。盡管如此，惡性腦膠質(zhì)瘤患者的平均存活時間僅為15個月[2]。TMZ耐藥是造成膠質(zhì)瘤患者治療效果不佳的主要原因。TMZ主要攻擊細(xì)胞DNA，造成DNA烷基化損傷，進(jìn)而形成DNA交聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3]。在眾多DNA烷基化損傷中，以O(shè)6-甲基鳥嘌呤（O6-mG）的損傷威脅最大，是引起細(xì)胞致死的重要原因[4]。機(jī)體對O6-mG的修復(fù)主要依賴O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT），此酶將甲基從DNA的O6位轉(zhuǎn)移到自身半胱氨酸殘基上，使DNA鏈上的鳥嘌呤損傷修復(fù)，同時MGMT不可逆地失活，是一種“自殺式”、可消耗酶[5-6]。臨床研究一些MGMT抑制劑作為TMZ輔助化療藥物，如O6-BG，但是，臨床試驗發(fā)現(xiàn)，O6-BG具有神經(jīng)毒性[7]。所以，設(shè)計既有TMZ活性作用，又能夠消耗MGMT蛋白的藥物具有重要的臨床意義。TMZ-HE是在TMZ結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上改造而來，保留原有藥物的作用基團(tuán)，其目的為在保留原有藥物的作用結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，增加藥物的脂溶性，使藥物進(jìn)入腫瘤內(nèi)部的濃度增加。起初，TMZ-HE作為治療皮膚癌而設(shè)計的前體藥，能夠抑制裸鼠異種移植的黑色素瘤的生長[8]。膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN-18由于自身MGMT表達(dá)屬于原發(fā)性耐藥細(xì)胞系[9-10]，本研究選取LN-18細(xì)胞系，旨在探索TMZ-HE體外對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用，同時對MGMT蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 TMZ、TMZ-HE由天津天士力公司提供，純度>99%。二甲基亞砜（DMSO）溶解配成100 mmol/L貯存液，置－20℃凍存。膠質(zhì)瘤LN－18細(xì)胞購于ATCC，由本實(shí)驗室凍存。改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’smodified Eagle’smedium，DMEM）胰蛋白酶購自Gibico公司，胎牛血清購自天津灝洋生物制品公司。四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、Hoechst33342熒光試劑盒、細(xì)胞凋亡試劑盒均為Sigma公司產(chǎn)品，MGMT抗體為CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) LN-18細(xì)胞用DMEM（含10%胎牛血清，1%雙抗）培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 MTT比色法 取對數(shù)生長期LN-18細(xì)胞，以0.25%胰蛋白酶消化，計數(shù)，稀釋成1×104/mL的單細(xì)胞懸液，接種至96孔板，過夜貼壁后，加入含TMZ、TMZ-HE 終濃度為 62.5、125、250、500、1 000 μmol/L的培養(yǎng)液作為處理組及濃度為0μmol/L的等量DMSO對照組，每種濃度設(shè)4個重復(fù)孔，并以空白孔調(diào)零。藥物作用24、48、72和96h后，每孔加入20μL 5mg/mLMTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸去上清,每孔加150μL DMSO,振蕩10min。490 nm波長處酶標(biāo)儀檢測吸收值（OD），結(jié)果以各組OD均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（實(shí)驗重復(fù)3次）。

1.2.3 二維克隆法 取對數(shù)生長期LN-18細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為200個/mL，以每孔1mL接種于12孔板，待細(xì)胞貼壁后，各實(shí)驗組加入含藥培養(yǎng)液（25～200μmol/L），陰性對照組分別加入等量的不含藥培養(yǎng)液，每組設(shè)2個復(fù)孔。每隔3 d換液，2周后取出培養(yǎng)板，甲醇-20℃固定10min,加入結(jié)晶紫染色液染色30min。顯微鏡下觀察克隆大小及數(shù)量，>50個細(xì)胞為克隆，計數(shù)。

1.2.4 Hoechst33342/PI熒光染色 取對數(shù)生長期LN-18細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，以每孔1mL接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入含TMZ、TMZHE（50～400 mol/L）培養(yǎng)液，作用 96 h 后，棄上清，PBS洗2遍，各孔均加入 Hoechst染料（10 g/mL）、PI染料（1μg/mL）500μL，37℃避光孵育 10min，棄去染料，加入培養(yǎng)液，熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡率 TMZ、TMZ-HE（50～400 mol/L）作用LN-18細(xì)胞96 h，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/mL，各取100μL；加入預(yù)冷的結(jié)合緩沖液100μL重懸細(xì)胞；加入5μLAnnexinV-FITC和PI染液于細(xì)胞懸液中,輕輕混勻，避光染色10min；補(bǔ)加200μL結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測凋亡的百分比。

1.2.6 Western blot法檢測MGMT蛋白的表達(dá) 收取蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，將等量蛋白（約50μg）在15%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜后封閉，4℃孵育MGMT兔抗人單克隆抗體過夜，TBST洗膜3次，兔抗熒光二抗孵育，TBST洗膜3次，熒光掃描儀掃描。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，組間分析比較用t檢驗。計量資料以x±s表示，采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMZ-HE對LN-18細(xì)胞活力的影響 MTT結(jié)果顯示，相同濃度梯度的TMZ、TMZ-HE作用膠質(zhì)瘤LN-18細(xì)胞24～96 h后，兩種藥物均具有增殖抑制作用，且具有濃度和時間依賴性（圖1）。TMZ在24、48、72、96 h 處的 IC50值分別為 （2 448±0.17）、（2 063±0.16）、（1 298±0.08）、（1 020±0.095）μmol/L，TMZ-HE 的 IC50值分別為 （318.2±0.03）、（215.9±0.04）、（204.3±0.04）、（178.3±0.05）μmol/L，作用 96 h TMZ和TMZ-HE的IC50值相差約5.72倍，具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001）。以上結(jié)果表明，TMZ-HE對膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN-18的增殖抑制效果明顯優(yōu)于TMZ。

圖1 TMZ,TMZ-HE作用LN-18細(xì)胞24、48、72、96 h后細(xì)胞存活率Fig 1 Survival ratesof the LN-18 glioma cells treated by different concentrationsof TMZ and TMZ-HE for 24,48,72 and 96 h

2.2 TMZ-HE對LN-18細(xì)胞克隆形成的影響 克隆結(jié)果顯示，TMZ、TMZ-HE對LN-18克隆形成均有抑制作用，隨著藥物濃度增加，克隆形成數(shù)量也隨著減少，但TMZ-HE的克隆抑制效果強(qiáng)于TMZ。如圖2所示，TMZ-HE作用LN-18細(xì)胞后，克隆數(shù)量明顯少于TMZ組，在200μmol/L的TMZ-HE作用下，能夠完全抑制克隆形成，而TMZ僅能抑制40%。

2.3 TMZ-HE誘導(dǎo)LN-18細(xì)胞發(fā)生凋亡情況TMZ-HE作用LN-18細(xì)胞96 h后，細(xì)胞凋亡率（包括早期凋亡和晚期凋亡）分別為8.4%、13.5%、14.9%、36.9%，死亡率為2.4%、5.4%、3.1%、6.5%，而TMZ誘導(dǎo)LN-18的凋亡率為7.1%、8.8%、11.5%、28.7%，死亡率為3.3%、2.8%、4.3%、7.3%。其結(jié)果表明，TMZ-HE誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤LN-18細(xì)胞發(fā)生的凋亡高于TMZ，具有濃度依賴性。但是，TMZ和TMZ-HE引起細(xì)胞的死亡數(shù)量較少，且沒有明顯的濃度依賴性，見圖3。

圖2 不同濃度TMZ,TM Z-HE作用LN-18后克隆形成數(shù)量百分比Fig 2 Effectsof graded TMZ and TMZ-HE on LN-18 colony form ation

圖3 TMZ,TMZ-HE作用LN-18細(xì)胞96 h后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率和死亡率Fig 3 Apoptosisand necrosisof LN-18 cellsby flow cytometry after treated with TMZ and TMZ-HE for 96 h

2.4 Hoechst33342/PI熒光染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化和細(xì)胞壞死情況 如圖4A所示，TMZ、TMZ-HE作用LN-18細(xì)胞96 h后，熒光顯微鏡下觀察可見細(xì)胞核熒光信號增強(qiáng)，同時，隨著濃度增加，細(xì)胞核數(shù)量不斷減少，但是相同濃度下的TMZ-HE組細(xì)胞核數(shù)量減少的更多。相同作用條件下，PI染色觀察可見，隨著兩種藥物濃度增加，壞死細(xì)胞沒有明顯增加，且熒光信號較少，幾乎沒有壞死，見圖4B。這與筆者流式檢測的結(jié)果相符，說明TMZ-HE更多的誘導(dǎo)LN-18細(xì)胞發(fā)生凋亡，且誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡率高于TMZ，其結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 Hoechst33342(A)/PI(B)染色觀察TMZ、TMZ-HE對LN-18細(xì)胞核的影響及壞死情況（×10）Fig 4 Hoechst33342(A)/PI(B)stainingwasobserved in TMZ,TMZ-HE effecton LN-18 cellnucleiand necrosis(×10)

2.5 TMZ-HE對LN-18細(xì)胞耐藥蛋白MGMT的影響 Western blot結(jié)果顯示，兩種藥物能夠使MGMT表達(dá)量降低，其具有濃度依賴性。但是，TMZ-HE能夠較TMZ更早更多的消耗MGMT蛋白，100μmol/L的TMZ-HE能夠完全消耗細(xì)胞中MGMT蛋白，而TMZ則需要更高濃度，見圖5。

圖5 TMZ,TMZ-HE對LN-18細(xì)胞中耐藥蛋白MGMT的影響Fig 5 Theeffectof TMZ,TMZ-HE on the resistant proterin MGMT in LN-18 cells

3 討論

GBM是…級腦腫瘤，年發(fā)病率為5～8/10萬，具有生長迅速、侵襲性強(qiáng)等特性，使得手術(shù)徹底切除困難，極易復(fù)發(fā)[11]。目前對GBM的治療采用手術(shù)和放化療的綜合治療方式[12]。TMZ是臨床治療惡性腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的標(biāo)準(zhǔn)一線化療藥物。臨床研究表明，TMZ對人惡性腦膠質(zhì)瘤的有效率在45%左右，GBM對TMZ的耐藥性是化療失敗的主要原因[7,13]。其中，DNA修復(fù)酶MGMT是耐藥的主要原因之一[14-15]。有研究表明，白藜蘆醇能夠抑制MGMT蛋白的表達(dá)，與TMZ聯(lián)合使用能夠增加TMZ的敏感性[16]。TMZ治療膠質(zhì)瘤的作用效果與MGMT蛋白的消耗和合成的速率有關(guān)[5]。本研究通過檢測TMZ-HE對LN-18的作用效果，可以初步探索TMZ-HE是否能夠克服TMZ耐藥。研究結(jié)果表明，新型烷化劑TMZ-HE能夠較TMZ更早更多地降低膠質(zhì)瘤LN-18細(xì)胞中MGMT蛋白的表達(dá)含量，相應(yīng)可以增加DNA損傷，導(dǎo)致更多的細(xì)胞死亡。通過凋亡等相應(yīng)功能性實(shí)驗結(jié)果表明TMZ-HE的作用效果明顯優(yōu)于TMZ，具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明TMZ-HE能夠通過降低MGMT的表達(dá)增強(qiáng)對LN-18的作用效果。TMZ-HE是在TMZ結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上改造而來，保留了原有的作用基團(tuán)，所以，通過凋亡檢測和熒光染色結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)TMZ和TMZ-HE都主要誘導(dǎo)LN-18細(xì)胞發(fā)生凋亡，而細(xì)胞死亡幾乎沒有檢測到。這與Roos等[17]研究的TMZ能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的結(jié)果一致。但是，細(xì)胞發(fā)生凋亡的途徑有很多，會受到各種因素的影響，如p53在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的狀態(tài)不同，會誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生不同途徑的凋亡[18]。所以，TMZ-HE誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的途徑是否與TMZ完全相同，其增加的酯結(jié)構(gòu)是否僅影響藥物的滲透能力還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗通過MTT法、二維克隆法證明了TMZHE對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的短期和長期作用效果都優(yōu)于TMZ，但兩者有一個共同點(diǎn)，即長期的作用效果更加明顯，200μmol/L TMZ能夠抑制60%的克隆形成，TMZ-HE甚至完全抑制LN-18克隆的形成。TMZ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生的時間為96 h，這是因為TMZ首先導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，研究發(fā)現(xiàn)，通過藥物抑制自噬能夠增加TMZ誘導(dǎo)的凋亡[19-20]。TMZ-HE在96 h處誘導(dǎo)LN-18細(xì)胞發(fā)生更多的凋亡，這是由于TMZ-HE本身能夠抑制自噬導(dǎo)致凋亡增多，還是和TMZ相同，先發(fā)生自噬，然后誘導(dǎo)更多的凋亡，這是筆者值得探討的問題。

綜上所述，本研究證明了TMZ-HE能夠通過下調(diào)MGMT蛋白抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN-18的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，TMZ-HE較TMZ作用效果更好，對治療膠質(zhì)瘤有很好的應(yīng)用前景。因此，TMZ-HE是否能夠克服TMZ耐藥以及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制是進(jìn)一步研究的主要內(nèi)容。這些研究大多數(shù)還是建立在體外實(shí)驗上，由于體內(nèi)外環(huán)境差別較大，要想更好地了解TMZ-HE在膠質(zhì)瘤中的作用，還有待進(jìn)一步開展TMZ-HE在體內(nèi)的相關(guān)研究。

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