3種蕓薹屬植物ROH1基因的克隆及分析

張賀翠 廉小平 柳菁 李幫秀 周燕

摘要 ?[目的]通過(guò)PCR和RTPCR技術(shù)從甘藍(lán)、白菜和蘿卜中擴(kuò)增ROH1基因序列，分析該基因的基本特性。 [方法]采用生物信息學(xué)的相關(guān)方法進(jìn)行分析。[結(jié)果] 甘藍(lán)、白菜、蘿卜ROH1基因沒(méi)有內(nèi)含子，甘藍(lán)ROH1基因編碼398個(gè)氨基酸，白菜和蘿卜ROH1基因均編碼400個(gè)氨基酸，3種植物的ROH1蛋白序列與擬南芥已經(jīng)公布的ROH1（At1g63930）蛋白氨基酸缺少一段連續(xù)的氨基酸序列;ROH1屬于DUF793蛋白超家族，它沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成。同源比對(duì)及功能聯(lián)想分析發(fā)現(xiàn)植物中ROH1非常保守，系統(tǒng)發(fā)育分析表明甘藍(lán)、白菜和蘿卜的關(guān)系最近;結(jié)構(gòu)功能分析發(fā)現(xiàn)ROH1可能與BYPASS蛋白和AT4G11300蛋白的功能相似。[結(jié)論] 為研究DUF793蛋白超家族功能提供參考。

關(guān)鍵詞 ROH1基因;基因克隆;DUF793蛋白超家族

中圖分類號(hào) S188 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A ?文章編號(hào) 0517-6611（2015）03-018-04

Cloning and Analysis of ROH1 from Three Brassica Plants

ZHANG Hecui， LIAN ?Xiaoping， LIU Jing et al

（College of Agronomy and Biotechnology ， Southwest University ， Chongqing 400716）

Abstract ? [Objective]The sequences of ROH1 genes were amplified by PCR and RT-PCR from three Brassica plants which are Brassica oleracea， Brassica rape and ?Raphanus sativus. [Method]Using relevant methods of bioinformatics analyzes. [Result] The results indicated that the gDNA of ROH1 was without introns， ROH1 gene encodes 398 amino acids in Brassica oleracea when it encodes 400 amino acids in the Brassica rape and Raphanus sativus. A continuous period of amino acids was deleted from the ROH1 in the three plants which were compared to ROH1 （At1g63930） in Arabidopsis thaliana; ROH1 belonged to DUF793 protein superfamily， and it might not be a transmembrane domain with no a signal peptide. The secondary structure of ROH1 mainly composed of αhelix and random coil constituted. Homologous alignment and function of the association analysis showed that ROH1 was very conservative， and phylogenetic analysis showed that there were closely relationship between Brassica oleracea， Brassica rape and ?Raphanus sativus; The structure and function analysis found that ROH1 may resemble to BYPASS protein and AT4G11300 protein . [Conclusion] The study provided a reference for the study of function about DUF793 protein super family.

Key words ?ROH1 gene; Gene clone; ?DUF793 protein super family

基金項(xiàng)目 中央高?；緲I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（XDJK2013C121）

作者簡(jiǎn)介 張賀翠（1985- ），女，河南滑縣人，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)方面的研究。

收稿日期 20141125

囊泡分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程是真核細(xì)胞生命活動(dòng)的基本事件之一，是神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)和內(nèi)分泌激素釋放的基礎(chǔ)，細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)重要的信號(hào)蛋白或者膜蛋白需要借助囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌來(lái)實(shí)現(xiàn)^[1]。囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌過(guò)程中，由多亞基組成的7類復(fù)合物被證明在真核細(xì)胞的內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)和囊泡拴系過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其中研究最為活躍和進(jìn)展最快的是Exocyst，它是由SEC3、SEC5、SEC6、SEC8、SEC10、SEC15、EXO70 和 EXO84 8亞單位構(gòu)成^[2]。

Elias等^[3]首先從水稻和擬南芥中發(fā)現(xiàn)了EXO70A1，它是EXO70家族中的一員。Li等^[4]研究顯示EXO70A1介導(dǎo)的膜泡運(yùn)輸參與了導(dǎo)管細(xì)胞次生壁的形成，EXO70A1突變導(dǎo)致導(dǎo)管運(yùn)輸功能障礙，進(jìn)而影響擬南芥的生長(zhǎng)和育性，SEC8則和Exo70、SEC6形成一個(gè)穩(wěn)定的亞復(fù)合體。Ivan等^[5]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)EXO70A1和SEC8同時(shí)與另一種蛋白R(shí)OH1相互作用，ROH1突變引起種子中果膠沉積的消失;擬南芥ROH1（At1g63930）基因沒(méi)有內(nèi)含子，編碼415個(gè)氨基酸，屬于一種未知功能的DUF793蛋白家族成員之一，DUF793家族在擬南芥中至少含有11個(gè)成員，分別為At1g01550，At1g18740，At1g22030，At1g43630，At1g74450，At1g77855，At2g46080，At4g01360，At4g11300，At4g23530;據(jù)預(yù)測(cè)ROH1與BYPASS1（At1g01550）基因的結(jié)構(gòu)具有高度相似性，BYPASS1與根冠的運(yùn)輸有關(guān)，因此ROH1蛋白可能參與囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)^[6]。但目前對(duì)甘藍(lán)、白菜和蘿卜ROH1蛋白編碼序列及其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

筆者以高度自交不親和甘藍(lán)E1、白菜和蘿卜為材料，利用PCR和RTPCR的方法，首次對(duì)甘藍(lán)、白菜和蘿卜的ROH1蛋白編碼序列進(jìn)行了克隆與序列分析，進(jìn)一步了解該編碼序列的結(jié)構(gòu)與功能，并探究ROH1序列及其編碼的蛋白質(zhì)在甘藍(lán)、和擬南芥中存在的結(jié)構(gòu)和功能差異。

1 材料與方法

1.1 材料 供試材料為高度自交不親和甘藍(lán)E1、白菜和蘿卜。

1.2 方法 利用植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen，北京）提取甘藍(lán)葉片gDNA。各個(gè)時(shí)期柱頭和其他組織RNA的提取參照RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒（Tiangen，北京）操作說(shuō)明進(jìn)行。使各種材料RNA量相同，以等體積Oligo dTprimers和random6 mers混合物為引物，參照Primescript反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TakaRa，日本）操作說(shuō)明合成cDNA第一條鏈。反轉(zhuǎn)錄完成后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以甘藍(lán)、白菜和蘿卜的gDNA和cDNA為模板擴(kuò)增ROH1基因，ROH1上游引物：CGCAAGTAATCAAGGCTCG，下游引物：GAAACTTTCCCGGCTTGCTC，反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 4 min;94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min終止。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，以DNA膠回收試劑盒純化回收。產(chǎn)物回收后與T載體連接，將重組克隆載體導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，挑取陽(yáng)性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

序列分析和系統(tǒng)分析分別采用VecoterNTI、MEGA6，在線分析軟件分別使用NCBI、COILS、TMHMM2.0、SignalP、GeneMANIA等。

2 結(jié)果與分析

2.1 ROH1基因克隆及進(jìn)化分析

以甘藍(lán)E1、白菜、蘿卜為材料，利用PCR及RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物ROH1，連接PMD19-T載體，送華大基因組測(cè)序，結(jié)果表明，ROH1的全長(zhǎng)gDNA序列與cDNA序列完全一致，均為1 197 bp;蘿卜和白菜的全長(zhǎng)gDNA序列與cDNA序列長(zhǎng)度均為1 203 bp，完全等同于1%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果（圖1）。

經(jīng)測(cè)序和比對(duì)發(fā)現(xiàn)（圖2），甘藍(lán)中ROH1編碼區(qū)序列和gDNA序列都是由1 197 bp構(gòu)成，表明甘藍(lán)中ROH1沒(méi)有內(nèi)含子，編碼398個(gè)氨基酸;蘿卜和白菜的核苷酸序列長(zhǎng)度均

注：M.Marker，1.甘藍(lán)gDNA，2.甘藍(lán)gDNA，3.白菜gDNA，4.白菜gDNA，5.蘿卜gDNA，6.蘿卜cDNA。

圖1 ROH1的cDNA 和gDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖譜

注：Bo.甘藍(lán);Br.白菜;At.擬南芥;Rs.蘿卜。

圖2 ROH1蛋白氨基酸的序列比對(duì)

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2015年

為1 203 bp，編碼400個(gè)氨基酸。通過(guò)NCBI下載擬南芥ROH1 基因序列（序列號(hào)：At1g63930），經(jīng)blast及VecoterNTI與已公布的擬南芥ROH1氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，4條序列的相似性達(dá)到87.6%，說(shuō)明ROH1基因的保守型很強(qiáng)。甘藍(lán)中ROH1與擬南芥中ROH1的相似性達(dá)到92%，白菜中ROH1與擬南芥中ROH1的相似性達(dá)到89.5%，蘿卜中ROH1與擬南芥中ROH1的相似性達(dá)到90.2%;甘藍(lán)中ROH1氨基酸序列比擬南芥中的ROH1氨基酸序列少17個(gè)氨基酸殘基，其中甘藍(lán)第56、57位點(diǎn)氨基酸比擬南芥中ROH1多2個(gè)氨基酸殘基，甘藍(lán)第299位點(diǎn)氨基酸比擬南芥中ROH1氨基酸序列少1個(gè)氨基酸殘基，甘藍(lán)中ROH1比擬南芥中少一段連續(xù)的16個(gè)氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于擬南芥序列第191～208位點(diǎn)氨基酸殘基，序列為GGGGGNKTTERSWSFGR。白菜和蘿卜第56～58位點(diǎn)氨基酸比擬南芥ROH1多3個(gè)氨基酸殘基，同樣在對(duì)應(yīng)于擬南芥第192～208位點(diǎn)氨基酸處少一段連續(xù)的氨基酸序列，序列為GGGGGGNKTTERSWSFGR。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，蘿卜、甘藍(lán)、白菜和擬南芥中的ROH1基因與DUF793蛋白質(zhì)超家族的結(jié)構(gòu)一致性很高（圖3）。

圖3 ROH1蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

進(jìn)化樹(shù)可以描述來(lái)自于同一祖先的不同植物在進(jìn)化過(guò)程中的關(guān)系，通過(guò)構(gòu)建物種進(jìn)化樹(shù)，可以了解某種物種在進(jìn)化過(guò)程中的地位。依據(jù)氨基酸序列構(gòu)建的分子進(jìn)化樹(shù)能較真實(shí)地反映不同物種之間的系統(tǒng)分類學(xué)關(guān)系和自然演化進(jìn)程，對(duì)明確判斷物種間的親緣關(guān)系具有一定的參考價(jià)值。利用MEGE6軟件對(duì)DUF793蛋白超家族的多個(gè)物種構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，由圖4可知，在DUF793家族進(jìn)化樹(shù)中，甘藍(lán)、白菜和蘿卜

注：Bo.甘藍(lán);Br.白菜;At.擬南芥;Rs.蘿卜;At4g11300等見(jiàn)表1。

圖4 多個(gè)物種DUF793蛋白超家族氨基酸進(jìn)化樹(shù)分析

ROH1蛋白聚在一起，和油菜、擬南芥聚在一支，說(shuō)明甘藍(lán)、白菜和蘿卜

ROH1蛋白可能與AT4G11300具有相似的功能。

2.2 ROH1卷曲螺旋及跨膜結(jié)構(gòu)域分析

對(duì)ROH1二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)（表2），甘藍(lán)、白菜和蘿卜中ROH1的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能存在α螺旋、β轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈，其中α螺旋占整條序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的比例最高，其次是無(wú)規(guī)則卷曲，β轉(zhuǎn)角和延伸鏈占的比例非常小，由此可知，ROH1的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成。

蛋白質(zhì)卷曲螺旋是一種超二級(jí)結(jié)構(gòu)，通常由2～7個(gè)α-螺旋互相纏繞形成麻花狀結(jié)構(gòu)，其中2個(gè)或4個(gè)α-螺旋互相纏繞最為常見(jiàn)，含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)是纖維狀蛋白質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)模式，在植物生命體中具有重要意義。通過(guò)在線分析工具COILS 對(duì)甘藍(lán)、白菜和蘿卜ROH1進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，3個(gè)物種的ROH1在對(duì)應(yīng)于甘藍(lán)氨基酸350～380處均存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。

用TMHMM2.0預(yù)測(cè)甘藍(lán)、白菜和蘿卜ROH1蛋白無(wú)明顯跨膜區(qū)（圖6），蛋白全部位于膜外。用SignalP分析ROH1的信號(hào)肽，通過(guò)不斷截短的方式最后發(fā)現(xiàn)ROH1沒(méi)有信號(hào)肽。

2.3 ROH1信號(hào)路經(jīng)分析

GeneMANIA可以發(fā)現(xiàn)信號(hào)途徑或蛋白復(fù)合體的新成員，可作為蛋白篩選結(jié)果的補(bǔ)充。使用該工具對(duì)ROH1進(jìn)行檢索，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，擬南芥中發(fā)現(xiàn)ROH1與EXO70家族的EXO70A1和EXO70E2相互作用，數(shù)據(jù)庫(kù)中還存在18種與ROH1蛋白共沉淀、共表達(dá)和具有相同結(jié)構(gòu)域的蛋白。數(shù)據(jù)庫(kù)中有8種蛋白與ROH1具有相同的結(jié)構(gòu)域，這些蛋白均屬于DUF793蛋白超家族，大多數(shù)為功能研究較少的蛋白，其中

AT2G46080和AT1G22030編碼類BYPASS蛋白。AT1G43630、AT1G74450、AT1G01550

與形態(tài)發(fā)育有關(guān);AT4G23530、AT2G46080、AT1G18740是與

表1 多個(gè)物種的信息

序列號(hào)物種序列號(hào)物種

XP_007222897.1Prunus persicaBAF29255.1Oryza sativa Japonica Group

XP_004173411.1Cucumis sativusQ9LMM6.1Arabidopsis thaliana

CBI34385.3Vitis viniferaAEE29757.1Arabidopsis thaliana

XP_006305065.1Capsella rubellaAt1g77855Arabidopsis thaliana

XP_006434464.1Citrus clementinaAT4G23530Arabidopsis thaliana

KDO86277.1Citrus sinensisAt4g11300Arabidopsis thaliana

XP_006413544.1Eutrema salsugineumAEE82015.1Arabidopsis thaliana

NP_001240854.1Glycine maxAT2G46080Arabidopsis thaliana

NP_001144572.1Zea maysAT1G74450Arabidopsis thaliana

AET04440.1Medicago truncatulaAT1G43630Arabidopsis thaliana

XP_007160104.1Phaseolus vulgarisAT1G22030Arabidopsis thaliana

XP_008365274.1Malus domesticaAtROH1Arabidopsis thaliana

EES19085.1Sorghum bicolor

表2 ?3種不同植物ROH1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果%

名稱α螺旋延伸鏈β轉(zhuǎn)角無(wú)規(guī)則卷曲

BoROH154.529.304.7731.41

BrROH160.753.501.7534.00

RsROH160.004.002.0034.00

囊泡運(yùn)輸有關(guān)的蛋白;AT1G22030、AT4G11300是與Exocyst有關(guān)的蛋白;AT1G74450、AT1G01550是與根系形態(tài)發(fā)育有關(guān)的蛋白。與進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果一致。

3 討論

甘藍(lán)ROH1基因編碼398個(gè)氨基酸，白菜和蘿卜ROH1基因編碼400個(gè)氨基酸，均比擬南芥ROH1少一段連續(xù)的氨基酸序列，可能是物種進(jìn)化中自然選擇造成的，因此這3種植物ROH1在進(jìn)化上較接近，在DUF793進(jìn)化樹(shù)中聚在

一支而與擬南芥較遠(yuǎn)。在對(duì)甘藍(lán)、白菜和蘿卜ROH1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中，發(fā)現(xiàn)3種植物ROH1都沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)，ROH1可能主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，存在卷曲螺旋超二級(jí)

注：綠、藍(lán)、黃線分別表示不同尺寸窗口的預(yù)測(cè)。

圖5 ROH1卷曲螺旋預(yù)測(cè)

圖6 ROH1跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖7 ROH1蛋白的功能聯(lián)想數(shù)據(jù)分析

結(jié)構(gòu)^[7]，預(yù)測(cè)有一定

的準(zhǔn)確度且ROH1蛋白的氨基

酸序列的疏水性不是很強(qiáng)，可能預(yù)測(cè)不出來(lái)。信號(hào)肽是新合成多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移的N-末端的氨基酸序列，一般由 16～26 個(gè)氨基酸組成，包括一個(gè)帶正電荷的 N-末端，一個(gè)中間疏水序列和一個(gè)較長(zhǎng)的帶負(fù)電荷的 C-末端，通過(guò)不斷截短的方式預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)ROH1蛋白沒(méi)有信號(hào)肽。

ROH1是Ivan等利用酵母雙雜交、定點(diǎn)突變等技術(shù)從擬南芥中篩選出來(lái)的蛋白，它與Exocyst復(fù)合體中的EXO70A1、EXO70E2和SEC8相互作用，通過(guò)與EXO70家族基因之間的共調(diào)控表明ROH1和Exocyst復(fù)合體之間存在某種聯(lián)系;據(jù)Ivan推測(cè)ROH1的突變可以引起種皮果膠的沉積，破壞了種皮的正常功能，因此ROH1可能是分泌的負(fù)調(diào)節(jié)因子。ROH1屬于DUF793蛋白超家族，通過(guò)GeneMANIA 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)與ROH1有共同結(jié)構(gòu)域的8種蛋白質(zhì)均屬于DUF793家族，其中5種蛋白與分泌和囊泡運(yùn)輸有關(guān);Van等^[8]研究發(fā)現(xiàn)ROH1與BYPASS1（At1g01550）基因的結(jié)構(gòu)具有高度相似性，BYPASS1與根冠的運(yùn)輸有關(guān);Kang等^[9]推測(cè)BYPASS及其同源基因在不同物種和不同組織中具有不同的生物學(xué)功能;其他研究結(jié)果也表明BYPASS可能廣泛參與了各種生理活動(dòng)^[9-10]。劉豫東等^[11]從甘藍(lán)的柱頭內(nèi)擴(kuò)增出BYPASS基因，據(jù)推測(cè)BYPASS蛋白可能參與了甘藍(lán)的生殖發(fā)育過(guò)程;AT2G46080和AT1G22030編碼類BYPASS蛋白與ROH1蛋白具有相同的結(jié)構(gòu)域，因此ROH1蛋白也可能與根冠運(yùn)輸和生殖發(fā)育有關(guān)。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)、蘿卜、白菜ROH1蛋白可能與DUF793蛋白超家族的AT4G11300蛋白功能相似^[12]，AT4G11300蛋白與Exocyst相關(guān)（raghvendra），與Ivan等發(fā)現(xiàn)的ROH1和Exocyst復(fù)合體之間存在某種聯(lián)系這個(gè)觀點(diǎn)一致，同時(shí)說(shuō)明DUF793蛋白家族可能具有抑制分泌的功能。

應(yīng)用生物信息學(xué)的方法對(duì) ROH1 的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，有利于利用試驗(yàn)的手段研究植物ROH1 的分子生物學(xué)性質(zhì)和理化性質(zhì)，對(duì)物種間 ROH1家族的親緣關(guān)系和遺傳相似性的分析，對(duì)新ROH1基因的發(fā)現(xiàn)和研究有較大的幫助^[13]。Ivan等在擬南芥中發(fā)現(xiàn)ROH1蛋白與EXO70A1、

EXO70E2和SEC8相互作用，甘藍(lán)、白菜、蘿卜ROH1蛋白比擬南芥ROH1蛋白少一段連續(xù)的氨基酸序列，因此甘藍(lán)、白菜、蘿卜ROH1與Exocyst復(fù)合體亞基是否存在相互作用，ROH1是否與分泌和囊泡運(yùn)輸有關(guān)，ROH1是否與生殖發(fā)育

有關(guān)，這些都是下一步研究的內(nèi)容，以期為研究DUF793蛋白超家族功能提供參考。

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