• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    重組H5N1 流感血凝素桿狀病毒滴度熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立、驗(yàn)證及應(yīng)用

    2021-10-20 08:24:48吳清勝吳相英姚春萍李媛媛
    中國生物制品學(xué)雜志 2021年10期
    關(guān)鍵詞:桿狀病毒滴度質(zhì)粒

    吳清勝,吳相英,姚春萍,李媛媛,

    1.國藥中生生物技術(shù)研究院有限公司,北京101111;2.北京生物制品研究所有限責(zé)任公司,北京100176

    桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(baculovirus expressionvector system,BEVS)是以桿狀病毒為外源基因載體,以昆蟲細(xì)胞為受體的一種真核表達(dá)系統(tǒng),具有效率高、容量大、表達(dá)產(chǎn)物能進(jìn)行折疊和修飾等特點(diǎn)[1-3]。自20 世紀(jì)80 年代建立以來,BEVS 已經(jīng)發(fā)展為成熟的生物制品生產(chǎn)平臺(tái),有多種產(chǎn)品獲批,包括獸用疫苗、人用疫苗及治療產(chǎn)品[4-8]。桿狀病毒不會(huì)刺激哺乳動(dòng)物產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答,也不會(huì)對(duì)其造成功能性損傷,這些特性使其成為一種極具應(yīng)用前景的基因治療載體[9]。無論是疫苗研發(fā),還是基因治療[10-11],桿狀病毒滴度的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)均至關(guān)重要,熒光定量PCR(qPCR)法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)[12-14]。本文通過設(shè)計(jì)H5 基因的引物及探針,以Bacmid-H5 重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)模板,對(duì)PCR 的退火溫度及引物濃度進(jìn)行優(yōu)化,建立了檢測(cè)H5 基因拷貝數(shù)的qPCR 法,并對(duì)該方法的專屬性、重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證,確定線性范圍及檢測(cè)限,并應(yīng)用該方法和免疫熒光法[15]對(duì)H5 桿狀病毒連續(xù)傳代4 次及連續(xù)培養(yǎng)0 ~6 d 的樣品進(jìn)行檢測(cè)。

    1 材料與方法

    1.1 菌株、病毒及細(xì)胞 含重組rBacmid-H5 的E.coli菌株DH10Bac 由國藥中生研究院有限責(zé)任公司第七研究室制備,重組H5 桿狀病毒、重組H1 桿狀病毒、未重組桿狀病毒均由該室制備;Sf9 昆蟲細(xì)胞購自ATCC。

    1.2 主要試劑及儀器 SFX-Insect 培養(yǎng)基購自美國GE 公司;EASY Dilution(for Real Time PCR)、Probe qPCR Mix 購自日本TaKaRa 公司;無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;LB Brothready to use 購自生工生物工程(上海)股份有限公司;DNeasy?Blood&Tissue Kit 購自德國 QIAGEN 公司;StepOnePlus Real-time PCR System 購自美國ABI公司;Eppendorf BioPhotometer D30 核酸蛋白測(cè)定儀購自德國Eppendorf 公司。

    1.3 引物及探針 H5 基因上游引物(HA-F):5′-tac gcc gct gac aag gaa ag-3′,下游引物(HA-R):5′-ggt cca cac gtc cag gaa ac-3′;Tanqman 熒光探針:5′-act cag aag gcc atc gac ggc gtg ac-3′。均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.4 標(biāo)準(zhǔn)模板的制備 將rBacmid-H5 重組菌接種至含三抗(卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素終濃度分別為 50、7、10 μg / mL)的 LB 液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)過夜;12 000 ×g離心 5 min,收集菌體;無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取重組質(zhì)粒Bacmid-H5,充分混勻,利用Eppendorf BioPhotometer D30 核酸蛋白測(cè)定儀進(jìn)行檢測(cè),按公式①計(jì)算質(zhì)粒濃度,將Bacmid-HA 重組質(zhì)粒的堿基數(shù)4 007 bp 代入公式②得出copies。分裝凍存于-20 ℃。

    1.5 方法的建立

    1.5.1 退火溫度優(yōu)化 以提取的質(zhì)粒 rBacmid-H5 為標(biāo)準(zhǔn)模板,(53 ± 5)℃為退火溫度,進(jìn)行梯度PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。最亮的電泳條帶所對(duì)應(yīng)的退火溫度為最佳退火溫度。

    1.5.2 引物濃度優(yōu)化 根據(jù)線性范圍,在高濃度模板(8.5 × 109copies / μL)和適中濃度模板(2.3 ×106copies/μL)下,分別加入0.5、1、2、3μL 的10mmol / L引物進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增。選取Ct值最低(熒光值最高)的引物濃度為最佳引物濃度。

    1.6 方法的驗(yàn)證

    1.6.1 專屬性 將反應(yīng)體系確定為25 μL,包括10 μmol/L 的上、下游引物、探針各 1 μL,模板 1 μL,Probe qPCR Mix(2 ×)12.5 μL,ROX Reference Dye 0.5 μL,注射用水 8 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共 40 個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。

    以10 倍系列稀釋的rBacmid-H5 質(zhì)粒為模板繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以相同提取方法制備的重組H5 桿狀病毒的基因組DNA 為待檢樣品,以EASY Dilution稀釋液為空白對(duì)照,驗(yàn)證方法的專屬性。以重組H5桿狀病毒基因?yàn)殛栃詫?duì)照,PBS 為陰性對(duì)照,qPCR法檢測(cè)重組H1 桿狀病毒和未重組的桿狀病毒基因組DNA,重復(fù)2 次,進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

    1.6.2 線性范圍及檢測(cè)限 用EASY Dilution 對(duì)模板進(jìn)行稀釋,擴(kuò)大濃度范圍(7.36 × 10-3~ 8.5 ×109copies / μL),進(jìn)行 qPCR 檢測(cè),確定線性范圍及檢測(cè)限。

    1.6.3 重復(fù)性 將重組H5 桿狀病毒于27℃,120r/min搖瓶培養(yǎng)3 d;接種至傳代后1 d 的Sf9 細(xì)胞(活細(xì)胞密度為 1.86 × 106cells / mL,活率為 98.92%),取培養(yǎng)3 d 后的細(xì)胞(活細(xì)胞密度為1.77×106cells/mL,活率為47.62%)進(jìn)行檢測(cè)。在線性范圍內(nèi),將2.3×109copies / μL(即 10 μg / mL)的模板 10 倍稀釋至2.3 × 103copies / μL,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,使用 qPCR 法進(jìn)行檢測(cè),重復(fù)6 次。

    1.7 方法的初步應(yīng)用 采用qPCR 法對(duì)重組H5 桿狀病毒連續(xù)傳代4 次[培養(yǎng)3 d 左右(活率約50%)傳代,病毒與細(xì)胞體積比為1︰10]及連續(xù)培養(yǎng)0 ~6 d 的樣品進(jìn)行檢測(cè),并與免疫熒光法進(jìn)行比較[15]。

    2 結(jié) 果

    2.1 標(biāo)準(zhǔn)模板 rBacmid-H5 質(zhì)粒濃度為 37.5 μg/mL,拷貝數(shù)為 8.536 1 × 109copies / μL。

    2.2 方法的建立

    2.2.1 退火溫度 退火溫度在48.8 ~57.2 ℃(中點(diǎn)為53 ℃)范圍內(nèi),均可見目的擴(kuò)增條帶。根據(jù)目的條帶深淺,并結(jié)合引物的Tm 值,選取55 ℃為最佳退火溫度。見圖1。

    圖1 溫度梯度PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of temperature gradient PCR product

    2.2.2 引物濃度 適中濃度模板時(shí),加入0.5、1、2和3 μL 的引物,Ct值差異不明顯;高濃度模板時(shí),加入 1 μL 的引物,Ct值較低,見圖 2 和表 1。因此,最佳引物使用量確定為 1 μL 10 mmol / L 引物。

    圖2 不同濃度引物的定量PCR 反應(yīng)熒光強(qiáng)度曲線Fig.2 Fluorescent intensity curve of qPCR at various primer concentrations

    表1 兩種模板濃度下不同濃度引物的Ct 值Tab.1 Ct values of primers at different concentrations using templates at two concentrations

    2.3 方法的驗(yàn)證

    2.3.1 專屬性 qPCR 法檢測(cè)重組H1 及未重組的桿狀病毒(不含外源基因),均無熒光信號(hào),見表2。表明該方法特異性良好,不與未重組的桿狀病毒和流感病毒的其他亞型發(fā)生交叉反應(yīng)。

    表2 不同亞型重組流感桿狀病毒qPCR 法檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Detection results of recombinant baculovirus with influnenza virus of different subtypes by qPCR

    2.3.2 線性范圍及檢測(cè)限 模板濃度在1.15×103~4.25× 109copies/μL 之間,線性關(guān)系良好,R2=0.999,見圖 3。模板濃度低于 1.15 × 103copies / μL,偏離線性范圍,檢測(cè)值與陰性對(duì)照區(qū)分不明顯。見表3。確定檢測(cè)限為 1.15 × 103copies / μL。

    圖3 線性范圍及檢測(cè)限的試驗(yàn)數(shù)據(jù)圖Fig.3 Experimental data graph of linear range and detection limit

    表3 線性范圍及檢測(cè)限的確定Tab.3 Determination of linear range and detection limit

    2.3.3 重復(fù)性 重組H5 桿狀病毒培養(yǎng)3 d,重復(fù)檢測(cè)6 次,RSD為1.01%,見表4,表明重復(fù)性良好。

    表4 重復(fù)性驗(yàn)證Tab.4 Validation for reproducibility

    2.4 方法的初步應(yīng)用 H5 桿狀病毒連續(xù)傳代4 次,病毒滴度保持相對(duì)穩(wěn)定,qPCR 法的檢測(cè)值高于免疫熒光法,見表5;H5 病毒連續(xù)培養(yǎng)0 ~6 d,病毒滴度在第3 天達(dá)到較高值,qPCR 法的檢測(cè)值高于免疫熒光法,見表6。

    表5 H5 桿狀病毒連續(xù)傳代 4 次的病毒滴度(copies / mL)Tab.5 Detection results of titer of H5 baculovirus subcultured for four passages(copies / mL)

    表6 H5 桿狀病毒連續(xù)培養(yǎng) 0 ~ 6 d 的病毒滴度(copies / mL)Tab.6 Detection results of titer of H5 baculovirus cultured for 0 ~ 6 d(copies / mL)

    3 討 論

    重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中可能會(huì)丟失目的基因,產(chǎn)生缺陷干擾病毒(defective interfering particles,DIs)[16-18],導(dǎo)致外源蛋白的表達(dá)量顯著降低[19]。應(yīng)用Bac-to-Bac 技術(shù)構(gòu)建的重組桿狀病毒,遺傳不穩(wěn)定性更加明顯[20]。這些缺陷顆粒的產(chǎn)生和不斷積累,會(huì)嚴(yán)重影響目的蛋白的產(chǎn)量[21]。本研究建立的qPCR 方法,能夠特異性的檢測(cè)H5 基因。該方法通過檢測(cè)外源基因得到定量結(jié)果,為有效的重組病毒含量,避免了缺陷性病毒顆粒對(duì)檢測(cè)值的干擾。

    測(cè)定桿狀病毒滴度的方法主要有蝕斑法、終點(diǎn)稀釋法、免疫染色法、流式細(xì)胞術(shù)法、實(shí)時(shí)定量熒光PCR 法(real-time qPCR)等。基于核酸的檢測(cè)和免疫測(cè)定方法是病毒檢測(cè)常用的方法。免疫染色法或免疫熒光染色法,在培養(yǎng)3 d 后,再包括加入一抗、二抗等多個(gè)步驟,每步操作均可能對(duì)滴度檢測(cè)值產(chǎn)生影響。實(shí)際檢測(cè)中,形成的熒光斑點(diǎn)大小不一,經(jīng)常存在多個(gè)斑點(diǎn)聚集的大斑點(diǎn),而且需要?jiǎng)趧?dòng)強(qiáng)度較大的人工顯微鏡下斑點(diǎn)計(jì)數(shù),由于對(duì)斑點(diǎn)的取舍以及可能存在多計(jì)或者漏記,因此人為讀數(shù)誤差較大;此外,檢測(cè)中,還發(fā)現(xiàn)滴度與細(xì)胞代次或細(xì)胞狀態(tài)有一定關(guān)系,這也是重復(fù)性較差的因素之一。

    疫苗的生產(chǎn)過程中,一般需對(duì)病毒滴度進(jìn)行快速檢測(cè),或?qū)ε囵B(yǎng)過程中,病毒滴度的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。免疫熒光法耗時(shí)較長,而qPCR 法具有快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì),對(duì)于工藝的穩(wěn)定性控制具有重要意義。qPCR 法檢測(cè)的為基因copies,如果待檢樣品中存在缺陷病毒或者死病毒,檢測(cè)值將會(huì)偏高;在實(shí)際應(yīng)用中,qPCR 法可作為快速檢測(cè)方法進(jìn)行應(yīng)用,滿足時(shí)效性要求,而準(zhǔn)確的滴度值可再應(yīng)用其他方法進(jìn)行復(fù)檢(蝕斑法或免疫法)。然而,對(duì)于特定產(chǎn)品,在成熟工藝或者GMP 生產(chǎn)條件下,培養(yǎng)參數(shù)、保存條件和保存時(shí)間相對(duì)固定,病毒的活力會(huì)相對(duì)穩(wěn)定,批間差異小,基因拷貝數(shù)與病毒活力之間的關(guān)系或者比值較為固定,qPCR 法檢測(cè)的參考意義將更大。

    猜你喜歡
    桿狀病毒滴度質(zhì)粒
    桿狀病毒載體滅活方法的研究進(jìn)展
    不同富集培養(yǎng)方法對(duì)噬菌體PEf771的滴度影響
    南美白對(duì)蝦白斑綜合癥桿狀病毒病(WSSV)的危害及預(yù)防措施
    重組腺相關(guān)病毒基因藥物三種滴度的比較與分析
    自身免疫性肝病診斷中抗核抗體與自身免疫性肝病相關(guān)抗體檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    《豬流行性腹瀉病毒N蛋白桿狀病毒表達(dá)與間接ELISA方法建立》圖版
    凡納濱對(duì)蝦對(duì)蝦桿狀病毒PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對(duì)其增殖的影響
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
    国产午夜精品久久久久久| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 日日干狠狠操夜夜爽| tocl精华| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 老司机在亚洲福利影院| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲成国产人片在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 日本黄色视频三级网站网址| 精品国产美女av久久久久小说| 校园春色视频在线观看| 亚洲av美国av| 精品一区二区三区av网在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| www.999成人在线观看| 亚洲av美国av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产精品 欧美亚洲| 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 午夜亚洲福利在线播放| 老司机福利观看| 无限看片的www在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 色综合站精品国产| 亚洲欧美激情综合另类| 一本综合久久免费| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久中文字幕一级| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲一区二区三区不卡视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 国产97色在线日韩免费| 日本熟妇午夜| 成人av一区二区三区在线看| 久久久久久大精品| 成年免费大片在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 啦啦啦免费观看视频1| 精品国产乱码久久久久久男人| 精品无人区乱码1区二区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 色哟哟哟哟哟哟| 国产成年人精品一区二区| 国产成人影院久久av| 国产99久久九九免费精品| 丝袜在线中文字幕| 国产一区二区在线av高清观看| 久久九九热精品免费| 欧美大码av| 亚洲专区国产一区二区| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 黑人操中国人逼视频| 好男人电影高清在线观看| 久久久久久久午夜电影| 99热6这里只有精品| 亚洲av片天天在线观看| 美女大奶头视频| 成在线人永久免费视频| 一本一本综合久久| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产高清有码在线观看视频 | 日韩精品免费视频一区二区三区| 精品乱码久久久久久99久播| 久久久国产精品麻豆| 欧美成人性av电影在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 欧美zozozo另类| 精品免费久久久久久久清纯| 日本 欧美在线| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产精品亚洲av一区麻豆| 成年女人毛片免费观看观看9| 老司机福利观看| 黄色a级毛片大全视频| 热re99久久国产66热| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲全国av大片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产爱豆传媒在线观看 | 精品人妻1区二区| 999精品在线视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久婷婷成人综合色麻豆| 好男人电影高清在线观看| 日本五十路高清| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产免费av片在线观看野外av| 男女床上黄色一级片免费看| 男女床上黄色一级片免费看| 国产精品精品国产色婷婷| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 男女之事视频高清在线观看| 又大又爽又粗| 久9热在线精品视频| 99久久国产精品久久久| 性欧美人与动物交配| 色av中文字幕| 亚洲第一电影网av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久99热这里只有精品18| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产麻豆成人av免费视频| 久久人妻av系列| 亚洲午夜理论影院| 国产伦在线观看视频一区| 曰老女人黄片| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 美女 人体艺术 gogo| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 黄色a级毛片大全视频| 色播在线永久视频| 久久香蕉精品热| 久久精品人妻少妇| 精品国产美女av久久久久小说| 久久久久久大精品| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 日本在线视频免费播放| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲第一av免费看| 听说在线观看完整版免费高清| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲av片天天在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久精品91蜜桃| av天堂在线播放| 黄片小视频在线播放| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 免费人成视频x8x8入口观看| 日本一区二区免费在线视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 午夜免费鲁丝| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 午夜免费成人在线视频| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲五月天丁香| 久久香蕉激情| 欧美黑人精品巨大| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产成人影院久久av| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 淫妇啪啪啪对白视频| 日本一区二区免费在线视频| 狂野欧美激情性xxxx| 久久伊人香网站| 国产激情欧美一区二区| 757午夜福利合集在线观看| 日韩免费av在线播放| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美激情高清一区二区三区| 麻豆av在线久日| 十分钟在线观看高清视频www| 久久久久精品国产欧美久久久| 怎么达到女性高潮| 国语自产精品视频在线第100页| 日韩欧美 国产精品| 欧美黑人精品巨大| 男女之事视频高清在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美一级a爱片免费观看看 | 婷婷六月久久综合丁香| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产熟女xx| 一区二区日韩欧美中文字幕| 午夜激情福利司机影院| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 黄色视频不卡| 久99久视频精品免费| 黄色丝袜av网址大全| 激情在线观看视频在线高清| 欧美日本亚洲视频在线播放| 啦啦啦 在线观看视频| 久99久视频精品免费| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲色图av天堂| 色在线成人网| 男女之事视频高清在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产熟女xx| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 无人区码免费观看不卡| 精品国产乱子伦一区二区三区| 欧美日本视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| av天堂在线播放| 久久久久久国产a免费观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久草成人影院| 一区二区三区国产精品乱码| 国产精品1区2区在线观看.| 国产又色又爽无遮挡免费看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 精品欧美国产一区二区三| 成人亚洲精品av一区二区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲精品在线观看二区| 成人手机av| 国产伦一二天堂av在线观看| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 嫩草影视91久久| 日本 欧美在线| 一区二区三区国产精品乱码| 99精品欧美一区二区三区四区| 欧美丝袜亚洲另类 | 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲精品美女久久av网站| 精品午夜福利视频在线观看一区| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲五月天丁香| 亚洲国产欧美网| 久久精品国产清高在天天线| 一级片免费观看大全| 国产精品九九99| 大型黄色视频在线免费观看| 国产在线观看jvid| 天堂动漫精品| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 1024手机看黄色片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 白带黄色成豆腐渣| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 可以在线观看的亚洲视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲av第一区精品v没综合| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 日韩精品免费视频一区二区三区| videosex国产| 国产av又大| 大型av网站在线播放| 俺也久久电影网| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久久久久免费高清国产稀缺| 1024香蕉在线观看| 午夜福利在线观看吧| 首页视频小说图片口味搜索| 人人妻人人看人人澡| 黄色 视频免费看| 欧美黄色片欧美黄色片| 99riav亚洲国产免费| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 午夜精品在线福利| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 在线观看www视频免费| 日韩欧美三级三区| 亚洲成av人片免费观看| 最新美女视频免费是黄的| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产精品一区二区三区四区久久 | 成人三级做爰电影| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 欧美激情 高清一区二区三区| 特大巨黑吊av在线直播 | 亚洲国产中文字幕在线视频| 丁香欧美五月| 国产亚洲欧美98| 老汉色∧v一级毛片| 日日夜夜操网爽| 亚洲国产看品久久| 国产成人欧美在线观看| 国产三级在线视频| 热99re8久久精品国产| 日韩中文字幕欧美一区二区| 免费搜索国产男女视频| 无限看片的www在线观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 天堂影院成人在线观看| 久久精品人妻少妇| 真人一进一出gif抽搐免费| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久亚洲精品不卡| 精品日产1卡2卡| 日本五十路高清| 99精品久久久久人妻精品| 久久香蕉精品热| 亚洲黑人精品在线| 亚洲av五月六月丁香网| 免费搜索国产男女视频| 人人妻人人看人人澡| 1024香蕉在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久天堂一区二区三区四区| 精品久久久久久久久久久久久 | 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产爱豆传媒在线观看 | 一级毛片女人18水好多| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 男女那种视频在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美又色又爽又黄视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 一区二区三区高清视频在线| 好男人在线观看高清免费视频 | 很黄的视频免费| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日韩大码丰满熟妇| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲人成77777在线视频| 怎么达到女性高潮| 在线天堂中文资源库| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产久久久一区二区三区| 在线视频色国产色| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久久久亚洲av毛片大全| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久久久久人人人人人| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美三级亚洲精品| 嫁个100分男人电影在线观看| 精品福利观看| 亚洲黑人精品在线| 免费无遮挡裸体视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 超碰成人久久| 18禁美女被吸乳视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久男人| 精品高清国产在线一区| 久久久久久国产a免费观看| 国产99久久九九免费精品| 波多野结衣高清作品| 黄色丝袜av网址大全| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲片人在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 美女扒开内裤让男人捅视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 制服人妻中文乱码| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 黑丝袜美女国产一区| 麻豆一二三区av精品| 波多野结衣高清作品| 国产成人av激情在线播放| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产av一区二区精品久久| 精品欧美一区二区三区在线| 国产一区在线观看成人免费| 日韩欧美在线二视频| av在线播放免费不卡| 特大巨黑吊av在线直播 | 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 99精品在免费线老司机午夜| 91成年电影在线观看| 麻豆一二三区av精品| 视频区欧美日本亚洲| 国产99久久九九免费精品| 亚洲熟妇熟女久久| 精品国产国语对白av| a级毛片a级免费在线| 丁香六月欧美| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲av电影在线进入| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 人人妻人人看人人澡| 淫秽高清视频在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| а√天堂www在线а√下载| av电影中文网址| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 757午夜福利合集在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 精品不卡国产一区二区三区| 精品欧美国产一区二区三| 成人av一区二区三区在线看| 国产成人av教育| av中文乱码字幕在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 美女免费视频网站| 亚洲国产中文字幕在线视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美一级a爱片免费观看看 | 老司机午夜十八禁免费视频| 国产野战对白在线观看| 校园春色视频在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲第一青青草原| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 美国免费a级毛片| 欧美激情高清一区二区三区| 国语自产精品视频在线第100页| 在线观看午夜福利视频| 999精品在线视频| 女警被强在线播放| 午夜免费成人在线视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产一卡二卡三卡精品| 久久狼人影院| 免费在线观看成人毛片| 一级a爱片免费观看的视频| 久久草成人影院| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美午夜高清在线| 亚洲精品av麻豆狂野| 天天添夜夜摸| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 国产精品亚洲一级av第二区| a在线观看视频网站| 妹子高潮喷水视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 一a级毛片在线观看| 精品久久久久久成人av| 国产成年人精品一区二区| 国产1区2区3区精品| 天天添夜夜摸| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 大香蕉久久成人网| 999久久久国产精品视频| 国产私拍福利视频在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 成人免费观看视频高清| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲五月天丁香| 午夜两性在线视频| 操出白浆在线播放| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 在线播放国产精品三级| 长腿黑丝高跟| 国产亚洲精品av在线| 性色av乱码一区二区三区2| 国产精品一区二区精品视频观看| 高清毛片免费观看视频网站| 好男人电影高清在线观看| 国产区一区二久久| 丰满的人妻完整版| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲性夜色夜夜综合| 手机成人av网站| 日本 欧美在线| 动漫黄色视频在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 午夜福利欧美成人| 日本一本二区三区精品| 91成年电影在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 十八禁人妻一区二区| 精品电影一区二区在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲男人天堂网一区| 国产1区2区3区精品| 51午夜福利影视在线观看| 婷婷精品国产亚洲av| 成年人黄色毛片网站| 少妇粗大呻吟视频| 性欧美人与动物交配| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美最黄视频在线播放免费| 香蕉丝袜av| 国产精品一区二区精品视频观看| 男人操女人黄网站| 国产三级在线视频| 午夜久久久久精精品| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 中亚洲国语对白在线视频| 国产高清视频在线播放一区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 一进一出好大好爽视频| 色综合婷婷激情| 满18在线观看网站| 久久婷婷成人综合色麻豆| 亚洲一区高清亚洲精品| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产激情偷乱视频一区二区| 欧美在线一区亚洲| 999精品在线视频| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲,欧美精品.| 精品高清国产在线一区| 亚洲五月天丁香| 成人av一区二区三区在线看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产一卡二卡三卡精品| 午夜日韩欧美国产| 老鸭窝网址在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 在线av久久热| 亚洲精品色激情综合| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产av一区二区精品久久| 成人三级做爰电影| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品野战在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产成人欧美| 在线av久久热| 99精品欧美一区二区三区四区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 又大又爽又粗| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 成人免费观看视频高清| 日韩精品中文字幕看吧| 制服诱惑二区| 国产精品久久久av美女十八| 人人澡人人妻人| 久久中文字幕人妻熟女| 中文亚洲av片在线观看爽| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 脱女人内裤的视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲电影在线观看av| aaaaa片日本免费| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产成人精品久久二区二区免费| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲国产精品合色在线| 亚洲黑人精品在线| 一区二区三区激情视频| 久久久国产成人免费| 男人舔女人下体高潮全视频| 脱女人内裤的视频| av视频在线观看入口| 国产成人欧美| 成人三级做爰电影| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲最大成人中文| 欧美日韩福利视频一区二区| 两个人免费观看高清视频| 日日爽夜夜爽网站| 夜夜爽天天搞| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产久久久一区二区三区| 亚洲av电影在线进入| 亚洲成人免费电影在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 久久精品影院6| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 99精品久久久久人妻精品| av在线播放免费不卡| 男男h啪啪无遮挡| 中国美女看黄片| 午夜免费成人在线视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 日本免费a在线| 久久久久久免费高清国产稀缺| 特大巨黑吊av在线直播 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 欧美日韩一级在线毛片| 男女下面进入的视频免费午夜 | 久久精品影院6| 岛国在线观看网站| 亚洲成人久久爱视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产成人精品久久二区二区免费| 男人的好看免费观看在线视频 | 免费人成视频x8x8入口观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 成人亚洲精品一区在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久久久国产一级毛片高清牌| 99在线人妻在线中文字幕| 国产精品免费视频内射| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美午夜高清在线| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 麻豆成人午夜福利视频| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产精品一区二区精品视频观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 老司机在亚洲福利影院| 午夜老司机福利片| 一进一出好大好爽视频| 99国产精品一区二区三区| 后天国语完整版免费观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 一区二区三区精品91| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 99国产精品99久久久久| 国产成人影院久久av| 国产一区在线观看成人免费| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 免费在线观看亚洲国产| 国产91精品成人一区二区三区|