超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人血漿中氯苯那敏

粟 燕， 陳振玲

(1.凱里學(xué)院，貴州凱里 556011；2.中國民用航空局民用航空醫(yī)學(xué)中心，北京 100123；3.民航總醫(yī)院，北京 100123)

氯苯那敏是第一代抗組胺藥物，它可以通過人體血腦屏障進(jìn)入大腦，與腦部組織胺H1受體結(jié)合，產(chǎn)生鎮(zhèn)靜作用，具體表現(xiàn)為嗜睡、困倦、反應(yīng)遲鈍等[1 - 3]。其說明書中明確規(guī)定駕駛?cè)藛T工作期間禁用。國際民用航空公約附件13《航空器事故和事故征候調(diào)查》和《航空器事故和事故征候調(diào)查手冊(cè)》航空醫(yī)學(xué)調(diào)查規(guī)定，對(duì)飛行機(jī)組人員的藥物使用情況進(jìn)行調(diào)查，其中包括神經(jīng)類藥物進(jìn)行檢查。目前我國保健品存在非法添加西藥的情況，存在飛行人員誤服等可能性。因此，有必要建立靈敏、準(zhǔn)確測(cè)定人血漿中氯苯那敏的檢測(cè)方法，以配合事故和事故征候的調(diào)查?，F(xiàn)已建立的血漿中氯苯那敏檢測(cè)分析方法有高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。但上述方法檢出限較高、前處理步驟較為繁瑣，無法滿足事故或事故征候調(diào)查的需要[4 - 6]。

本研究建立了快速測(cè)定人體血漿中氯苯那敏的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測(cè)方法。該方法操作簡便、靈敏度高、重復(fù)性好，不僅可以滿足民航事故或事故征候調(diào)查需要，還可以應(yīng)用于路面駕駛事故調(diào)查以及添加少量氯苯那敏復(fù)方制劑藥代動(dòng)力學(xué)研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters XEVO TQ UPLC-MS/MS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，沃特斯公司)：BT25S百萬分之一天平(德國，Sartorius公司)；Milli-Q超純水機(jī)(德國，Millipore公司)；SIGMA 3-18K型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國，Sigma公司)。

氯苯那敏對(duì)照品溶液：精密稱取1.00 mg氯苯那敏對(duì)照品(迪馬公司，批號(hào)1.4)于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。標(biāo)準(zhǔn)工作液由甲醇稀釋而成。內(nèi)標(biāo)阿托伐他汀對(duì)照品溶液：精密稱取0.99 mg阿托伐他汀對(duì)照品(純度95.5%，中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)100590-200802)于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為945 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。內(nèi)標(biāo)工作液由甲醇稀釋而成。甲醇(色譜純，F(xiàn)isher公司)，乙酸銨(色譜純，Sigma公司)，甲酸(優(yōu)級(jí)純，Sigma公司)。

人體血漿由健康自愿者提供。

1.2 樣品處理

精密移取200 μL人體血漿于1.5 mL離心管中，加入10 μL氯苯那敏標(biāo)準(zhǔn)工作液，加入內(nèi)標(biāo)阿托伐他汀工作液2.0 μL，渦旋混勻60 s。加入甲醇500 μL，渦旋混勻60 s，4 ℃條件下，12 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定。

1.3 超高效液相色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱(150×2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：(A)5 mmol/L乙酸銨水溶液(0.1%甲酸)，(B)甲醇，梯度洗脫條件為：0～3 min，35%～20%A；3～5 min，20%～10%A；流速為0.2 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧正離子源(ESI+)，離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流速650 L/h，毛細(xì)管電壓3.0 kV；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)檢測(cè)。

表1 氯苯那敏和阿托伐他汀的質(zhì)譜分析參數(shù)

*Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇

實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇和乙腈兩種沉淀劑。結(jié)果表明，采用乙腈沉淀蛋白提取時(shí)，血漿樣品成團(tuán)狀沉淀，造成氯苯那敏和阿托伐他汀提取不完全，重復(fù)性較差；采用甲醇沉淀蛋白提取時(shí)，血漿沉淀呈均勻絮狀，重復(fù)性較好。分別考察了2、2.5、3、4倍的甲醇沉淀劑用量對(duì)氯苯那敏和阿托伐他汀響應(yīng)值的影響，結(jié)果表明隨著沉淀劑用量的增加，氯苯那敏信號(hào)峰逐漸變小。綜合考慮峰信號(hào)響應(yīng)值、方法的檢出限以及沉淀是否完全，選用2.5倍體積甲醇作為最佳沉淀劑用量。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)氯苯那敏和阿托伐他汀在電噴霧電離條件下的電離性質(zhì)，選擇在ESI+離子化模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，得到兩種化合物的準(zhǔn)分子離子[M+1]分別為m/z275.3、559.3。利用儀器自動(dòng)優(yōu)化功能進(jìn)一步對(duì)兩種化合物的準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析即子離子掃描，分別得到氯苯那敏和阿托伐他汀碎片離子信息，選擇合理丟失并且豐度較大的兩個(gè)碎片離子作為輔助定性離子，并以其中豐度最大的碎片離子作為定量離子，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3 色譜條件優(yōu)化

參考文獻(xiàn)的色譜條件[4 - 6]，分別以甲醇和乙腈為有機(jī)相，并且考慮到血漿樣品中含有大量有機(jī)化合物，基體復(fù)雜，采用梯度洗脫(有機(jī)相由65%上升到90%)程序，考察氯苯那敏和阿托伐他汀的出峰情況。結(jié)果表明，采用乙腈為有機(jī)相時(shí)，嘗試了多種梯度程序，兩種化合物的峰形均較差且拖尾；采用甲醇為有機(jī)相時(shí)，兩種化合物峰形獲得很大改善。對(duì)于乙腈和甲醇分別為有機(jī)相洗脫氯苯那敏和阿托伐他汀色譜峰出現(xiàn)的差別，推測(cè)兩種化合物在色譜柱洗脫過程中，它們與固定相、流動(dòng)相及樣本本身組分之間的復(fù)雜相互作用有關(guān)，當(dāng)乙腈為有機(jī)相時(shí)洗脫過程中兩種化合物在血漿組分影響下與固定相結(jié)合比較復(fù)雜，隨乙腈梯度增大難以迅速脫離固定相，形成拖尾；當(dāng)甲醇為有機(jī)相時(shí)洗脫過程中兩種化合物在血漿組分影響下與固定相結(jié)合比較簡單，隨甲醇梯度增加迅速脫離固定相隨流動(dòng)相進(jìn)入檢測(cè)器。當(dāng)水相采用0.1%甲酸水溶液時(shí)，兩種化合物響應(yīng)值較低，并且重復(fù)性較差；水相加入乙酸銨時(shí)，兩種化合物響應(yīng)值增加，并且重復(fù)性得以改善，說明乙酸銨可以促進(jìn)兩種化合物的電離。選用乙酸銨濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mmol/L，優(yōu)化乙酸銨用量，結(jié)果表明隨著乙酸銨濃度增加兩種化合物響應(yīng)值逐漸增大，濃度達(dá)到5.0 mmol/L時(shí)響應(yīng)值不再增加，因此選擇乙酸銨用量5.0 mmol/L。在上述色譜質(zhì)譜條件下，血漿樣品色譜分離良好，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾氯苯那敏和阿托伐他汀的測(cè)定，見圖1和圖2。

圖1 氯苯那敏色譜圖(下圖：空白血漿;上圖：空白血漿+氯苯那敏)Fig.1 The chromatograms of Chlortrimeton (a) Blank plasma+Chlortrimeton;(b) Blank plasma.

圖2 內(nèi)標(biāo)阿托伐他汀色譜圖(下圖：空白色漿；上圖：空白色漿+阿托伐他汀)Fig.2 The chromatograms of Atorvastatin(ISTD) (a) Blank plasma+Atorvastatin;(b) Blank plasma.

2.4 基質(zhì)效應(yīng)、檢出限、定量限及線性范圍

首先考察基質(zhì)效應(yīng)，取200 μL空白血漿，精密加入氯苯那敏系列對(duì)照品溶液10 μL和內(nèi)標(biāo)阿托伐他汀工作液2.0 μL，配制成氯苯那敏濃度為0.5、20.0、40.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品各5份，按照1.2節(jié)方法處理并進(jìn)行分析；同法分別用水代替血漿，按照上述方法處理。以每一種濃度的兩種不同處理方法分析得到的峰面積比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，內(nèi)標(biāo)阿托伐他汀的基質(zhì)效應(yīng)值為102.1%±4.6%，表明阿托伐他汀無明顯的基質(zhì)效應(yīng)。表2數(shù)據(jù)表明，血漿對(duì)氯苯那敏基質(zhì)效應(yīng)不顯著。

表2 血漿中氯苯那敏的基質(zhì)效應(yīng)考察

以3倍信噪比(S/N)作為檢出限，以10倍S/N作為定量限，經(jīng)過不斷稀釋樣品并分析檢測(cè)，血漿樣品中氯苯那敏的檢出限為0.05 μg/L，定量限為0.1 μg/L。

取200 μL空白血漿，加入氯苯那敏對(duì)照品，配制0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入內(nèi)標(biāo)阿托伐他汀工作液后，按照1.2節(jié)方法沉淀提取，進(jìn)行色譜質(zhì)譜分析，記錄氯苯那敏和阿托伐他汀峰面積，以氯苯那敏和阿托伐他汀峰面積比值(Y)對(duì)氯苯那敏質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，血漿樣品中氯苯那敏標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=0.0772X-0.0023(r=0.9995)，線性范圍為0.1～50.0 μg/L。

2.5 回收率、精密度及穩(wěn)定性

分別取含有氯苯那敏0.5、20.0和40.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，加入內(nèi)標(biāo)阿托伐他汀工作液2.0 μL，按照1.2節(jié)方法沉淀提取，測(cè)得氯苯那敏和阿托伐他汀的峰面積比，計(jì)算血漿中氯苯那敏的加入回收率，結(jié)果如表3所示。分別取含有氯苯那敏的低、中、高三種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，加入阿托伐他汀內(nèi)標(biāo)工作液，分別測(cè)定5次，計(jì)算精密度(RSD)。表3結(jié)果表明，血漿測(cè)定的日內(nèi)及日間RSD小于10%(n=5)，滿足藥物動(dòng)力學(xué)研究要求。

表3 血漿中氯苯那敏的添加回收率及日內(nèi)、日間精密度(n=5)

考察了氯苯那敏在不同儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性。配制含有氯苯那敏的低、中、高三種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，分別于室溫24 ℃放置8 h，于-20 ℃冰箱放置30 d，于-20 ℃冰箱凍存并反復(fù)凍融3次后處理樣品并進(jìn)行檢測(cè)，考察其室溫穩(wěn)定性、凍存穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性(n=5)；另考察經(jīng)過處理的質(zhì)控樣品放在儀器自動(dòng)進(jìn)樣室10 ℃、12 h后的穩(wěn)定性(n=5)。結(jié)果表明測(cè)定值的變異系數(shù)均小于15%，表明氯苯那敏的血漿樣品在室溫24 ℃放置8 h、-20 ℃冰箱放置30 d、反復(fù)凍融3次情況下，仍保持穩(wěn)定；處理后待檢的樣品在儀器自動(dòng)進(jìn)樣室10 ℃、12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

3 結(jié)論

建立了人血漿中氯苯那敏的UPLC-MS/MS測(cè)定方法。該方法快速、準(zhǔn)確、操作簡單、選擇性好、靈敏度高，可為可疑氯苯那敏藥物相關(guān)的民用航空器事故或事故征候調(diào)查提供靈敏可靠的檢測(cè)方法，并且可以用于路面駕駛事故調(diào)查及添加少量氯苯那敏復(fù)方制劑中氯苯那敏藥代動(dòng)力學(xué)研究。