固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定堅(jiān)果中62種農(nóng)藥殘留

楊 巍， 粟有志， 李 芳， 駱靈靜， 李艷美， 劉緒斌

(1.伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆伊寧 835000；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000；3.伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，新疆伊寧 835000)

堅(jiān)果又稱殼果、干果，其果實(shí)外部被堅(jiān)硬果殼包圍，食用部分多為果核內(nèi)的種仁子葉或胚乳。堅(jiān)果含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，具有健胃、補(bǔ)腦、預(yù)防疾病等多種功效，常被人們當(dāng)作保健食品食用[1]。近年來，隨著食品安全事件的頻發(fā)，農(nóng)藥殘留成為食品安全問題關(guān)注的焦點(diǎn)之一。歐盟規(guī)定了430余種農(nóng)藥在各類堅(jiān)果中的最大殘留限量(MRLs)，同時國際食品法典委員會(CAC)、美國、日本等國家或組織均對堅(jiān)果中的農(nóng)藥殘留設(shè)定了嚴(yán)格的MRLs[2]。目前，堅(jiān)果中農(nóng)藥殘留的檢測主要采用氣相色譜法[3]、液相色譜法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜法[5,6]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7,8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9 - 12]。其中氣相色譜法和液相色譜法均為半定性分析，不能對農(nóng)藥進(jìn)行確證，易產(chǎn)生假陽性；氣相色譜-質(zhì)譜法的目標(biāo)分析物碎片離子易受基質(zhì)的干擾，定性方面存在不足。李南等[7]建立了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時分析堅(jiān)果中185種農(nóng)藥殘留的方法，彌補(bǔ)了氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜法在確證方面的不足，但該方法儀器分析時間較長，單個樣品的分析時間在40 min以上。宋歡等[9]建立了超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定堅(jiān)果中18種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的方法，但該方法不能滿足幾十種農(nóng)藥殘留同時監(jiān)測的需要。

本文選擇有限量要求的62種農(nóng)藥為研究對象，采用固相萃取(SPE)凈化樣品，建立了同時分析堅(jiān)果干中62種農(nóng)藥殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260-6460A液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Agilent公司)，配有電噴霧離子源(ESI)；Sigma 3-18K臺式冷凍離心機(jī)(Sigma公司)；EYELA MMV-1000W振蕩器(東京理化公司)；GM200刀式混合研磨儀(Retsch公司)；N-EVAP-112水浴氮吹儀(Organomation公司)；Milli-Q Advangtage A10 超純水系統(tǒng)(Millipore公司)；MS3型渦旋振蕩器(IKA公司)。Carbon/PSA、Carbon/NH2、TPH、TPT固相萃取柱(規(guī)格均為1 g，6 mL)，購于Agela公司。

62種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品均購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司。乙腈、甲苯、正己烷、丙酮、甲酸、乙酸均為色譜純。其他試劑為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為經(jīng)Milli-Q超純水器純化的超純水。

分析樣品均為實(shí)驗(yàn)室送檢樣品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液精密稱取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確至0.01 mg)于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于-18 ℃冰箱中，備用。

1.2.2中間混合標(biāo)準(zhǔn)溶液根據(jù)每種農(nóng)藥在儀器上的響應(yīng)靈敏度，確定其在混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的濃度，用甲醇稀釋農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液至中間混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各農(nóng)藥的最終濃度為其檢出限的500倍。

1.2.3基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用不含待測農(nóng)藥殘留的空白試樣，按照1.3節(jié)處理樣品，制備空白樣品提取液。根據(jù)需要用空白樣品提取溶液和中間混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成合適濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，制備質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50倍定量限的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理

取代表性樣品500 g，去除外殼，經(jīng)混合研磨儀粉碎充分勻漿，密封，儲存于-18 ℃冰箱中備用。稱取5 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入10 mL水，放置30 min后，加入2 g NaCl和20 mL乙腈，水平振蕩15 min，6 000 r/min離心3 min，將上層乙腈層轉(zhuǎn)移至100 mL雞心瓶中，剩余部分用20 mL乙腈按照上述步驟重復(fù)提取一次，合并兩次乙腈層于雞心瓶中，向雞心瓶中加入乙腈飽和的正己烷20 mL，渦旋30 s，靜止5 min，棄去正己烷層，用20 mL乙腈飽和的正己烷重復(fù)操作一次，于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約1 mL，待固相萃取柱凈化。

在TPH固相萃取柱內(nèi)加入約2 cm高無水Na2SO4，固定于支架上，6 mL乙腈-甲苯(3∶1,V/V)預(yù)淋洗，當(dāng)預(yù)淋洗液液面到達(dá)無水Na2SO4的頂部時，迅速將上述樣品的濃縮液轉(zhuǎn)移至柱中，并用雞心瓶接收。再用2 mL乙腈-甲苯洗滌樣液瓶兩次，并將洗滌液轉(zhuǎn)移至柱中。在柱上連接50 mL儲液器，用20 mL乙腈-甲苯溶液洗脫農(nóng)藥，合并于雞心瓶，于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至約0.5 mL。將濃縮液置于氮吹儀上吹干，用1 mL乙腈-水溶液(3∶7,V/V)溶解殘?jiān)?，超聲溶?0 s，充分渦旋30 s，過0.22 μm濾膜，供HPLC-MS/MS測定和確證。

1.4 HPLC-MS/MS條件

1.4.1色譜條件色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18柱(100×3.0 mm，1.8 μm)；流動相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為乙腈，梯度洗脫程序如下：0～8.0 min,10%～75%B;8.0～15.0 min,75%～90%B;15.0～18.0 min,90%B;18.01～23.0 min,10%B；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10.0 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件電離模式：電噴霧正離子源模式；多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；霧化氣、干燥氣、鞘氣均為高純氮?dú)?；干燥氣溫度?50 ℃；干燥氣流量：9.0 L/min；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流速：11.0 L/min，毛細(xì)管電壓:4 kV；監(jiān)測離子對、碰撞能力、碎裂電壓等參見表1。

表1 62種農(nóng)藥的保留時間、監(jiān)測離子對、碰撞能量、碎裂電壓、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍、相關(guān)系數(shù)

(續(xù)表1)

No.CompoundtR(min) Mass transition(m/z)FV(V)CE(eV)Linear range(ng/L)r29Chlorldazon6.36222.0/77.1?;222.0/104.111520;3650.0-2500.00.993-0.99810Imidacloprid6.44256.0/175.2?;256.0/209.19012;2025.0-1250.00.996-0.99911Dimethoate6.62230.0/198.9?;230.0/125.0754;205.0-250.00.995-0.99912Acetamiprid6.67223.1/126.1?;223.1/56.210020;1210.0-500.00.993-0.99813Phosfolan6.84256.0/140.0?;256.0/61.113024;325.0-250.00.995-0.99914Thiacloprid7.38253.1/126.1?;253.1/90.211520;4010.0-500.00.994-0.99915Imazalil7.50297.1/159.0?;297.1/201.012816;2410.0-500.00.996-0.99816Oxadixyl7.83279.1/219.0?;279.1/132.0804;3610.0-500.00.995-0.99917Triasulfuron8.48402.1/141.1?;402.1/167.112816;2010.0-500.00.995-0.99918Methabenzthiazuron8.53222.1/150.1?;221.1/124.09236;325.0-250.00.996-0.99819Carbofuran8.54222.1/123.1?;222.1/165.18020;825.0-1250.00.995-0.99820Flutriafol8.65302.1/70.1?;302.1/123.011532;162.5-125.00.995-0.99821Pyrimethanil8.80200.2/82.1?;200.2/107.113524;2850.0-2500.00.996-0.99922Carbaryl8.87202.1/145.1?;202.1/127.1708;2810.0-500.00.995-0.99923Atrazine8.99216.1/174.0?;216.1/103.912016;282.5-125.00.994-0.99924Metalaxyl9.04280.2/220.1?;280.2/192.1908;122.5-125.00.996-0.99825Diuron9.10233.0/72.1?;233.0/160.010028;2050.0-2500.00.995-0.99926Carboxin9.11236.0/142.9?;236.0/86.910012;2025.0-1250.00.995-0.99927Propachlor9.58212.1/170.1?;212.1/94.19012;285.0-250.00.996-0.99828Paclobutrazol9.79294.1/70.1?;294.1/125.011344;205.0-250.00.995-0.99829Propanil9.92218.0/161.9?;218.0/127.09012;285.0-250.00.995-0.99830Phenmedipham9.98301.1/168.0?;301.1/136.1854;2050.0-2500.00.996-0.99931Famphur10.05326.0/217.0?;326.0/281.010212;1625.0-1250.00.995-0.99932Bupirimate10.07317.2/166.1?;317.2/210.213324;242.5-125.00.994-0.99933Prochloraz10.09376.0/308.0?;376.0/266.0968;125.0-250.00.996-0.99834Fenobucarb10.12208.1/95.1?;208.1/152.1754;1210.0-500.00.995-0.99935Chloroxuron10.20291.1/72.2?;291.1/164.112016;2025.0-1250.00.995-0.99936Fenarimol10.26331.0/81.1?;331.0/268.012524;3225.0-1250.00.996-0.99837Azoxystrobin10.40404.1/372.1?;404.1/344.110512;241.0-50.00.995-0.99838Myclobutanil10.41289.1/70.1?;289.1/125.011540;1610.0-500.00.995-0.99839Fenamidone10.49312.1/92.1?;312.1/236.111012;282.5-125.00.996-0.99940Triadimefon10.57294.1/69.2?;294.1/197.110012;205.0-250.00.995-0.99941Boscalid10.62343.0/307.1?;343.0/271.114020;3625.0-1250.00.994-0.99942Flusilazole10.72316.1/165.1?;316.1/247.113016;282.5-125.00.996-0.99843Tebuconazole10.75308.2/70.1?;308.2/124.911544;205.0-250.00.995-0.99944Isoxabem10.79333.2/165.1?;333.2/150.110216;442.5-125.00.995-0.99945Napropamide10.84272.2/171.0?;272.2/129.010016;122.5-125.00.996-0.99846Bitertanol10.99338.2/70.1?;338.2/99.110012;410.0-500.00.995-0.99847Flutolanil11.05324.1/262.1?;324.1/242.111216;285.0-250.00.995-0.99848Hexaconazole11.06314.1/70.2?;314.1/159.011732;2010.0-500.00.996-0.99949Malathion11.09331.0/126.9?;331.0/284.9700;425.0-1250.00.995-0.99850Penconazole11.09284.1/70.1?;284.1/159.012032;162.5-125.00.994-0.99951Triazophos11.13314.1/162.0?;314.1/119.111016;4025.0-1250.00.996-0.99852Tetrachlorvinphos11.17364.9/127.0?;364.9/203.910244;1250.0-2500.00.995-0.99953S-meyolachlor11.38284.2/252.1?;284.2/176.11008;2410.0-500.00.995-0.99954Difenoconazole11.79406.1/250.9?;406.1/337.012012;2410.0-500.00.993-0.99855Quinalphos11.94299.1/147.1?;299.1/163.010024;2010.0-500.00.995-0.99856Benalaxyl11.98326.2/148.0?;326.2/91.08016;445.0-250.00.995-0.99857Pyrazophos 12.38374.1/222.1?;374.1/194.112520;362.5-125.00.996-0.99958Pyraclostrobin 12.39388.1/163.1?;388.1/194.1958;241.0-50.00.995-0.99959Diazinon12.55305.1/169.1?;305.1/153.113020;200.5-25.00.997-0.99960Phoxim12.65299.1/77.1?;299.1/129.0768;3210.0-500.00.996-0.99861Thiobencarb12.74258.1/125.0?;258.1/89.110016;5050.0-2500.00.995-0.99962Phosalone12.76368.0/181.9;368.0/110.9808;4025.0-1250.00.996-0.999

*quantitative transition;FV：fragmentor voltage;CE:collision energy.

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

本文考察了正己烷-丙酮(1∶1,V/V)[13]、純乙腈[14]和乙腈(含1%乙酸)[15]三種提取溶劑對62種農(nóng)藥的提取效果。結(jié)果表明，正己烷-丙酮、乙腈和乙腈(含1%乙酸)作為提取溶劑時，回收率在70%～120%范圍內(nèi)的農(nóng)藥比例分別為83.8%、100.0%和91.9%；采用乙腈(含1%乙酸)提取時，部分堿性農(nóng)藥如呋蟲胺、嘧霉胺、噻蟲胺、敵稗的提取回收率較差。因此選擇乙腈作為提取溶劑。同時本文嘗試樣品提取后用乙腈飽和的正己烷進(jìn)行脫脂，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脫脂前后，62種農(nóng)藥的回收率沒有明顯的差異，約2/5的農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)有所改善。故本文最終選擇乙腈作為提取液，樣品提取液經(jīng)乙腈飽和的正己烷脫脂后，再進(jìn)行固相萃取(SPE)柱凈化。

2.2 凈化條件的選擇

2.2.1SPE柱的選擇由于62種農(nóng)藥化學(xué)性質(zhì)差異較大，選擇單一填料的SPE柱難以滿足樣品凈化的需要。本文比較Carb/PSA、Carb/NH2、TPT、TPH四種混合填料SPE柱對樣品的凈化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，回收率在70%～120%的農(nóng)藥數(shù)分別為60、58、62和62個。使用TPT、TPH柱時的回收率均較高；但TPT柱凈化時樣品基質(zhì)干擾相對較大，某些農(nóng)藥的峰形變差，個別農(nóng)藥監(jiān)測離子的背景信號較大，方法檢出限較高。故本文選擇TPH柱凈化樣品。

2.2.2洗脫溶劑的選擇選擇TPH SPE柱凈化樣品，對比乙腈-甲苯(3∶1,V/V)、乙腈、正己烷-丙酮(6∶4,V/V)三種洗脫溶劑的洗脫效果。結(jié)果表明，乙腈洗脫時部分農(nóng)藥的回收率達(dá)不到檢測要求；正己烷-丙酮和乙腈-甲苯洗脫時，62種農(nóng)藥的回收率均較好；但正己烷-丙酮洗脫時約3/4農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)高于乙腈-甲苯洗脫時的基質(zhì)效應(yīng)。所以本文選擇乙腈-甲苯(3∶1,V/V)為洗脫劑。

2.2.3洗脫體積的選擇進(jìn)一步優(yōu)化洗脫溶劑的體積，在空白核桃仁中添加62種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，按照1.3進(jìn)行前處理，在儲液器中加入40 mL洗脫溶劑，每5 mL收集一次流出液，共收集9次，并計(jì)算各次流出液中農(nóng)藥的累計(jì)回收率。結(jié)果表明，洗脫液體積超過20 mL后62種農(nóng)藥的回收率無明顯提高，故本文選擇洗脫劑乙腈-甲苯(3∶1,V/V)體積為20 mL。

2.3 儀器條件的選擇

配制62種農(nóng)藥的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別采用電噴霧正、負(fù)離子模式進(jìn)行母離子全掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)待測農(nóng)藥的[M+H]+峰均高于[M-H]-峰。以[M+H]+為母離子，進(jìn)一步對62種農(nóng)藥的子離子、碎裂電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳的儀器條件。基于優(yōu)化結(jié)果建立的多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析樣品時，流動相體系中有機(jī)相一般以乙腈、甲醇為主，水相中適當(dāng)添加一定量的緩沖物質(zhì)。本文比較不同濃度的甲酸水溶液和乙酸銨水溶液、乙腈及甲醇組成流動相的分離效果。結(jié)果表明，乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相時，各農(nóng)藥的響應(yīng)值較高。通過優(yōu)化梯度洗脫程序，62種農(nóng)藥均能得到較好的分離度和色譜峰形。核桃陰性樣品和陰性樣品中添加1×LOQ濃度的62種農(nóng)藥提取總離子流圖如圖1。

圖1 核桃陰性樣品(a)和陰性樣品中添加1×LOQ濃度(b)的62種農(nóng)藥提取總離子流色譜圖 Fig.1 Total ion chromatograms of a negative walnut sample(a) and a negative walnut sample spiked with 62 pesticides at LOQ concentration(b) number of 1-62 are the same as table 1.

2.4 方法的線性關(guān)系和定量限

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，樣品基質(zhì)對大部分的農(nóng)藥有一定的抑制作用，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線可有效地消除樣品基質(zhì)效應(yīng)?？瞻讟悠钒凑?.3節(jié)前處理樣品，制備質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50倍LOQ的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以峰面積對農(nóng)藥的質(zhì)量濃度作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；62種農(nóng)藥在核桃、杏仁、花生基質(zhì)中的相關(guān)系數(shù)均大于0.993。基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍和相關(guān)系數(shù)(r2)見表1。以信噪比(S/N) ≥3 確定方法的檢出限(LOD)，其范圍為0.03～3.0 μg/kg；以S/N≥10 確定方法的定量限(LOQ)，其范圍為0.1～10.0 μg/kg。所有農(nóng)藥的定量限均小于或等于10.0 μg/kg，符合國內(nèi)外法規(guī)殘留限量要求。62種農(nóng)藥的檢出限和定量限見表2。

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

選擇核桃仁、杏仁和花生仁三種陰性樣品，以1、2、4 倍LOQ為加標(biāo)水平進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。添加了農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品，靜置30 min，待農(nóng)藥被樣品充分吸收后，按照1.3節(jié)和1.4節(jié)進(jìn)行前處理和測定，每個水平重復(fù)6次。回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表2。從表2可見，62種農(nóng)藥回收率在71.2%～112.7%范圍，RSD小于5.8%～14.1%，表明該方法的準(zhǔn)確度高，通用性好。

表2 62種農(nóng)藥在核桃、杏仁、花生三種基質(zhì)中的檢出限、定量限、添加回收率和精密度(n=6)

(續(xù)表2)

No.CompoundLOD(μg/kg)LOQ(μg/kg)Spiked 1×LOQSpiked 2×LOQSpiked 4×LOQRecovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)38Myclobutanil0.62.079.09.784.56.790.19.539Fenamidone0.150.581.79.482.012.181.713.340Triadimefon0.31.0101.310.982.913.785.06.841Boscalid1.55.085.712.886.29.586.78.442Flusilazole0.150.579.66.581.29.483.110.643Tebuconazole0.31.071.88.382.110.683.110.944Isoxabem0.150.582.610.396.08.7103.46.745Napropamide0.150.576.98.685.97.771.29.546Bitertanol0.62.082.711.383.27.574.07.847Flutolanil0.31.081.913.482.712.575.29.548Hexaconazole0.62.0104.89.881.211.794.812.949Malathion1.55.071.58.796.89.781.910.050Penconazole0.150.576.710.986.09.790.29.551Triazophos1.55.083.18.578.911.490.212.652Tetrachlorvinphos3.010.087.911.782.210.779.711.053S-meyolachlor0.62.0112.714.178.97.993.08.254Difenoconazole0.62.092.49.582.27.879.79.555Quinalphos0.62.075.99.176.512.974.813.256Benalaxyl0.31.094.711.581.011.785.29.557Pyrazophos0.150.586.08.473.29.979.911.158Pyraclostrobin0.060.294.812.181.110.183.910.459Diazinon0.030.185.910.677.511.877.89.560Phoxim0.62.074.58.586.012.799.813.961Thiobencarb3.010.082.09.586.58.181.98.462Phosalone1.55.076.911.191.98.783.19.0

3 結(jié)論

本文建立了以乙腈為提取劑，經(jīng)正己烷脫脂和TPH固相萃取小柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定堅(jiān)果中62種農(nóng)藥殘留的檢測方法。該方法的定量限、回收率和精密度均滿足痕量分析的要求，適用于堅(jiān)果中農(nóng)藥殘留的分析檢測。