大孔吸附樹(shù)脂分離純化昆侖雪菊總黃酮工藝的研究

木合塔爾·吐?tīng)柡椋?木尼熱·阿不都克里木*， 熱陽(yáng)古·阿布拉, 夏 娜

(喀什大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆喀什 844000)

昆侖雪菊(Kunlun Snow Daisy)，又名“血菊”、“金雞菊”，維語(yǔ)“古麗恰爾” ，學(xué)名為兩色金雞菊( Coreopsis Tinctoria Nutt)，屬于菊科金雞菊屬，一年生草本植物的干燥頭狀花序，是一種具有新疆區(qū)域特色的菊花品種，主要分布在海拔3 000米的新疆和田昆侖山北麓[1,2]。昆侖雪菊花期短，產(chǎn)量稀少，是新疆目前唯一與雪蓮齊名且具有獨(dú)特功效的稀有高寒野生植物，具有調(diào)節(jié)三高、減肥養(yǎng)顏、抗菌消炎、營(yíng)養(yǎng)心肌、改善睡眠質(zhì)量等功效。昆侖雪菊是維吾爾族世代傳承下來(lái)的一種養(yǎng)生、保健的天然植物。維吾爾民族醫(yī)藥理論認(rèn)為昆侖雪菊具有高效降血脂、軟化血管、去除體內(nèi)垃圾，達(dá)到人體的體液平衡，主要對(duì)冠心病、高血脂、糖尿病有著特殊的療效。昆侖雪菊生物活性多樣，清香宜人，具有極佳的藥力作用，是天然保健功能極高的飲用品種。在藥品，食品、保健用品、保健食品等諸多領(lǐng)域具開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值[3]。

大孔吸附樹(shù)脂是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的有機(jī)高聚物吸附劑,在中草藥化學(xué)成分的分離、富集中的應(yīng)用日趨廣泛，其優(yōu)點(diǎn)在于吸附容量大，再生簡(jiǎn)單，效果可靠，適合于分離純化總黃酮成分。2012年，婁方明報(bào)道了大孔吸附樹(shù)脂分離純化巫山淫羊藿總黃酮的方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AB-8型大孔樹(shù)脂對(duì)巫山淫羊藿總黃酮的吸附總量、解吸附率、吸附速率均大于其他樹(shù)脂，純化后總黃酮含量可達(dá)70.20%[4]。2014年，沈先榮等人報(bào)道了大孔吸附樹(shù)脂分離純化枇杷花總黃酮工藝研究，結(jié)果顯示DM301樹(shù)脂對(duì)枇杷花總黃酮具有良好的吸附分離性能，產(chǎn)物經(jīng)干燥后總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高可以達(dá)到80%以上[5]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)11種大孔樹(shù)脂進(jìn)行了比較，采用靜態(tài)吸附方法篩選出純化昆侖雪菊中總黃酮的最佳樹(shù)脂，并對(duì)該大孔樹(shù)脂純化昆侖雪菊總黃酮的工藝條件進(jìn)行系統(tǒng)的研究，以期為開(kāi)發(fā)昆侖山雪菊總黃酮為主要成分的中藥新藥提供物質(zhì)基礎(chǔ)。因?yàn)槔鲅┚罩悬S酮的主要成分是蘆丁，所以實(shí)驗(yàn)中選用蘆丁作為對(duì)照品進(jìn)行分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與藥品

T6型新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；FA2104N電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海-恒科學(xué)儀器有限公司)；SHZ-3水循環(huán)真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；RE5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。

蘆丁對(duì)照品(純度為99.8%，中國(guó)藥品生物制品檢定所，編號(hào):100080)；NKA-9大孔吸附樹(shù)脂，AB-8大孔吸附樹(shù)脂0101型，大孔苯乙烯系敖合性樹(shù)脂D401，大孔強(qiáng)酸性苯乙烯陽(yáng)離子交換樹(shù)脂DO72，大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹(shù)脂D301，大孔強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交換樹(shù)脂D290，弱酸性丙烯酸系陽(yáng)離子交換樹(shù)脂D110，HZ-816大孔樹(shù)脂，HZ-806大孔樹(shù)脂；HZ-818大孔樹(shù)脂，D315大孔樹(shù)脂，均購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；Na2SO3，Al(NO3)3，無(wú)水乙醇，NaOH等試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

昆侖雪菊(新疆和田地區(qū)民豐縣山區(qū))經(jīng)喀什師范學(xué)院生物與地理科學(xué)系司馬義教授鑒定。

1.2 昆侖雪菊總黃酮含量測(cè)定[6 - 8]

1.2.1對(duì)照品溶液的制備精確稱(chēng)取恒重的純度為99.9%蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 20.08 mg,置于50 mL容量瓶中，加20 mL無(wú)水乙醇，超聲使其溶解后，用乙醇定容至刻度，搖勻。即得濃度為0.4016 mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.2供試品溶液的制備取昆侖雪菊50 g,加入20倍量的水,煮沸提取3次,每次2 h,過(guò)濾,合并濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮成浸膏。精密稱(chēng)取昆侖雪菊浸膏1 g，置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度作為供試液。

1.3 昆侖雪菊總黃酮的分離純化[9 - 11]

1.3.1大孔樹(shù)脂的預(yù)處理與再生用0.5 BV(1 BV為1個(gè)樹(shù)脂床體積)的乙醇浸泡樹(shù)脂24 h。用2 BV的乙醇以2 BV/h流速通過(guò)樹(shù)脂柱，并浸泡4到5 h，用乙醇2 BV/h 的流速洗滌樹(shù)脂至流出液加水后不呈白色混濁為止。再用水以同樣流速洗凈。用2 BV的5%HCl以4到6 BV/h 的流速通過(guò)樹(shù)脂層，并浸泡樹(shù)脂2到4 h，后用水以同樣流速洗至流出液pH值為中性。用2 BV的2%NaOH溶液以4到6 BV/h 的流速通過(guò)樹(shù)脂層并浸泡樹(shù)脂2 h到4 h 后，用水以同樣流速洗至流出液pH值為中性。

1.3.2大孔樹(shù)脂的篩選及上樣量的確定精確稱(chēng)取預(yù)處理好的濕樹(shù)脂3 g，置于磨口錐形瓶中，加入30 mL昆侖雪菊黃酮的粗提取液，蓋好瓶塞，在室溫下連續(xù)攪拌12 h，充分吸附后過(guò)濾，測(cè)定濾液中剩余總黃酮含量，計(jì)算總黃酮的吸附量和吸附率。向?yàn)V去吸附液的樹(shù)脂中加入60 mL 一定濃度的乙醇，在室溫?cái)嚢? h后過(guò)濾，測(cè)定濾液的總黃酮含量,計(jì)算總黃酮的洗脫率。

1.3.3吸附液pH值的確定分別取5份供試液50 mL，用5%HCI分別調(diào)節(jié)pH值為2、3、4、5、6后，加入到一系列1.0 g已去表面水的最佳的樹(shù)脂中，振蕩吸附24 h，測(cè)定吸附后溶液中總黃酮含量，計(jì)算出樹(shù)脂的吸附量，根據(jù)樹(shù)脂的吸附量的結(jié)果選擇最佳pH值。

1.3.4洗脫劑乙醇濃度的確定按照1.3.2中方法過(guò)濾吸附已達(dá)飽和樹(shù)脂，加入適量水洗滌，分別置于有玻璃塞的磨口錐形瓶中,依次加入40 mL 30%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇進(jìn)行解吸，測(cè)定洗脫液中黃酮含量,計(jì)算出樹(shù)脂的吸附量，根據(jù)樹(shù)脂的吸附量的結(jié)果選擇最佳乙醇的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定昆侖雪菊總黃酮含量

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精確吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別置于25 mL量瓶中，加6 mL無(wú)水乙醇,再加5%Na2SO3溶液 1 mL，混勻，放置 6 min后加10%Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，放置 6 min，加4%NaOH溶液10 mL，再加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，放置 15 min，以無(wú)水乙醇為空白，在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(c)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=15.508c-0.0044，蘆丁濃度在0.008～0.080 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.9995。

2.1.2顯色穩(wěn)定性試驗(yàn)精確吸取0.5 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液至25 mL容量瓶中，按2.1.1中方法進(jìn)行定容顯色。在波長(zhǎng)為510 nm處，每隔15 min測(cè)定一次吸光度。結(jié)果顯示，蘆丁與鋁鹽生成的絡(luò)合物顏色在60 min內(nèi)的變化很小，其吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.304%，表明60 min內(nèi)顯色穩(wěn)定性好。

2.1.3精密度試驗(yàn)精密吸取1 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)5次測(cè)吸光度，其結(jié)果的RSD為0.27%，表明測(cè)定方法的精密度良好。

2.1.4回收率試驗(yàn)精密吸取供試液0.5、0.6、0.8、1.0、1.5 mL然后分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 mL，分別用水補(bǔ)充至6 mL，按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行顯色并測(cè)定其吸光值，每一個(gè)試樣重復(fù)測(cè)定3次，取平均值，用回歸方程計(jì)算總黃酮濃度，進(jìn)而得出加標(biāo)回收率分別為98.6%、98.93%、100.25%、100.41%、100.65%，均在95%～105%范圍。

2.1.5總黃酮含量的測(cè)定精確吸取供試液1 mL，按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定總黃酮含量，昆侖雪菊供試品中總黃酮含量為16.62%。

2.2 昆侖雪菊總黃酮的分離純化工藝研究

2.2.1大孔吸附樹(shù)脂篩選將選用的NKA-9、AB-8、D401、DO72、D301、D290、D110；HZ-816、HZ-806、HZ-818、D315型樹(shù)脂按1.3.1和1.3.2中方法進(jìn)行靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大孔樹(shù)脂的篩選

由表1可以看出，AB-8、HZ-806、NKA-9、HZ-816、HZ-818 5大孔樹(shù)脂的吸附率和解吸率高于其它樹(shù)脂，D290型吸附樹(shù)脂雖然吸附率很高，但解吸率非常低。AB-8型樹(shù)脂的吸附率比NKA-9大孔吸附樹(shù)脂高而HZ-806型樹(shù)脂的吸附率比NKA-9大孔吸附樹(shù)脂低，但是這兩種樹(shù)脂的解吸率均不如NKA-9大孔吸附樹(shù)脂；HZ-816和HZ-818樹(shù)脂雖然解析率與NKA-9大孔吸附樹(shù)脂相近，但吸附率明顯低于NKA-9大孔吸附樹(shù)脂。綜合考慮，選用NKA-9大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行純化實(shí)驗(yàn)。

2.2.2吸附液pH值的確定黃酮類(lèi)化合物為多羥基酚類(lèi)，呈弱酸性，因而在弱酸性或酸性條件下易被吸附。由圖1可知，當(dāng)提取液的酸性越強(qiáng),吸附后提取液的顏色變化很明顯。吸附量隨著提取液的pH值增大而增大，當(dāng)提取液的pH=5時(shí)，吸附量最大，但是pH>5時(shí)，吸附量隨著提取液的pH值增大反而下降，因此提取液的pH=5為最佳提取方案。

2.2.3洗脫劑乙醇濃度的確定分析圖2的結(jié)果可知，當(dāng)70%乙醇作為洗脫劑時(shí)解吸率最高，即解吸液中的黃酮含量最高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明70%濃度的乙醇極性與提取液中黃酮的極性相似，故易于洗脫。

圖1 溶液pH 值對(duì)吸附率的影響Fig.1 Effoct of pH on adsorption rate

圖2 乙醇濃度對(duì)洗脫率的影響Fig.2 Effect of concentration of ethanol on rate elution

3 結(jié)論

吸附樹(shù)脂用于昆侖雪菊總黃酮的分離,省去了傳統(tǒng)溶劑萃取法的繁瑣工藝,僅吸附→洗脫一步工藝即可得到高含量的昆侖雪菊總黃酮,而且收率高、成本低、操作簡(jiǎn)便,適于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)篩選出適用于昆侖雪菊黃酮分離純化用的大孔吸附樹(shù)脂 NKA-9，同時(shí)確定最佳吸附條件為：上柱液 pH 為5.0、洗脫劑乙醇濃度為70%。該方法為昆侖雪菊黃酮類(lèi)物質(zhì)的分離和鑒定提供了基礎(chǔ)。