西藏小型豬慢性肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型的建立

劉　蓉， 侯　夢(mèng)， 廖海星， 張新鳳， 趙　瑾， 劉寶驊，錢(qián)元新， 吳清洪， 莫自耀， 廖東江， 李洪濤， 顧為望

（1. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 廣州 510120； 2. 廣州醫(yī)科大學(xué) 呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510230； 3. 南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 廣州 510515）

·論著·

西藏小型豬慢性肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型的建立

劉蓉1，2， 侯夢(mèng)1，2， 廖海星1， 張新鳳1， 趙瑾1，2， 劉寶驊1，錢(qián)元新1， 吳清洪3， 莫自耀1，2， 廖東江1，2， 李洪濤1，2， 顧為望3

（1. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 廣州 510120； 2. 廣州醫(yī)科大學(xué) 呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510230； 3. 南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 廣州 510515）

目的 采用野百合堿（MCT）誘導(dǎo)方法建立幼齡西藏小型豬慢性肺動(dòng)脈高壓（PH）動(dòng)物模型，并通過(guò)右心導(dǎo)管術(shù)和肺臟結(jié)構(gòu)形態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 2月齡西藏小型豬12頭， 體質(zhì)量5.0～6.0 kg。隨機(jī)均分為實(shí)驗(yàn)組（MCT組）和對(duì)照組，分別腹腔注射給予MCT 12.0 mg/kg和同樣劑量的溶劑（體積分?jǐn)?shù)75%乙醇）； 6周后采用右心導(dǎo)管術(shù)測(cè)定小型豬肺動(dòng)脈壓； 觀察小型豬右心肥大指數(shù)和肺組織病理改變。結(jié)果 與對(duì)照組相比，MCT組西藏小型豬平均肺動(dòng)脈壓顯著增加（24.62±1. 38 mmHg vs 15.10±0.76 mmHg，P＜0.01）。肺組織有明顯血管堵塞、血管腔消失，也可見(jiàn)肺小血管重構(gòu)，有肺小動(dòng)脈閉塞、向心性?xún)?nèi)膜增厚（叢狀血管）的改變。實(shí)驗(yàn)組小型豬右心肥大指數(shù)增加明顯（0.36±0.16 vs 0.28±0.13， P＜0.01）。結(jié)論 通過(guò)腹腔注射MCT 6 周后，可以建立西藏小型豬慢性PH動(dòng)物模型，其病理特征與人類(lèi)PH臨床指標(biāo)相似。

肺動(dòng)脈高壓（PH）； 野百合堿（MCT）； 西藏小型豬； 右心導(dǎo)管術(shù)

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary hypertension， PH）是一種以肺血管阻力進(jìn)行性升高、最終導(dǎo)致患者右心功能衰竭為特征的惡性肺血管疾病。臨床上肺動(dòng)脈血壓增高的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：在海平面狀態(tài)下，靜息時(shí)右心導(dǎo)管檢查肺動(dòng)脈收縮壓＞30 mmHg （1 mmHg= 0.133 kPa） 和 （或）肺動(dòng)脈平均壓＞25 mmHg，或者運(yùn)動(dòng)時(shí)肺動(dòng)脈平均壓＞30 mmHg［1-3］。目前其發(fā)病機(jī)制還不完全清楚，而動(dòng)物模型的建立是研究其發(fā)病機(jī)制的主要途徑［4］。過(guò)去使用較多的為大鼠模型，但由于其體型較小、血流動(dòng)力學(xué)特征差別較大； 其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如兔［5］、羊［6］和犬［7，8］等模型， 也有相關(guān)研究， 但利用超聲心動(dòng)圖所獲得的PH相關(guān)指標(biāo)有限。為克服這些缺點(diǎn)， 本研究在前期研究基礎(chǔ)上［9］選用幼齡小型豬作為造模對(duì)象，觀察模型動(dòng)物的表現(xiàn)，以期為臨床PH的治療研究建立一個(gè)穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型。

1　材料與方法

1.1材料

2月齡普通級(jí)西藏小型豬12頭，雌雄兼用， 體質(zhì)量5.0～6.0 kg， 由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK粵2011-0015］。動(dòng)物飼養(yǎng)在南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心普通級(jí)設(shè)施不銹鋼籠具中［SYXK（粵）2011-0074］， 房間溫度23～29℃， 相對(duì)濕度55%～80%，光照周期12 h/12 h。定期喂食，自由飲水，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例的要求。

野百合堿（monocrotaline， MCT）購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司（HPLC， 99.0%），醫(yī)用酒精配成25%注射溶液。肝素鈉注射液（江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司）和生理鹽水按比例（0.9%氯化鈉溶液+ 肝素鈉10 U/mL） 混合后， 用注射器吸入一定容量備用。4F心導(dǎo)管（Cordis Corp.， 墨西哥）中充滿肝素生理鹽水， 導(dǎo)引鋼絲也涂上肝素生理鹽水。地西泮注射液（天津金耀氨基酸有限公司）每支10 mg/2 mL，戊巴比妥鈉（美國(guó)Sigma公司）配成3%濃度。

1.2方法

12頭西藏小型豬隨機(jī)均分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組（MCT組）。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射MCT 12.0 mg/kg，對(duì)照組給予約同樣體積的溶劑（體積分?jǐn)?shù)75%乙醇）； 給藥第3周和第6周采靜脈血取血漿備用。給藥6周后，采用右心導(dǎo)管術(shù)測(cè)定每頭小型豬肺動(dòng)脈壓。

小型豬肺動(dòng)脈壓測(cè)定的具體方法： 打開(kāi)MedLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)（V6.0， 南京美易科技公司），把心導(dǎo)管和換能器連接起來(lái)， 接入三通閥和換能器（換能器和插管中充滿肝素生理鹽水， 注意不要有氣泡）。小型豬經(jīng)麻醉（地西泮注射液6 mg/kg +戊巴比妥鈉溶液10 mg/kg）后仰臥位捆綁在實(shí)驗(yàn)用床上，自由呼吸。通過(guò)外科手術(shù)暴露右頸內(nèi)靜脈約20 mm后， 將5F擴(kuò)張管和外套管（Cordis Corp.， 墨西哥）置入靜脈內(nèi)， 拔出擴(kuò)張管，固定外套管。在導(dǎo)引鋼絲幫助下，將導(dǎo)管經(jīng)外套管送入右頸內(nèi)靜脈→前腔靜脈→右心房→右心室→肺動(dòng)脈主干。整個(gè)過(guò)程均在X光透視條件下進(jìn)行（Toshiba Medical Systems Corp.，DBX-6000A， 日本），以確保導(dǎo)管端口位于肺動(dòng)脈主干部位。退出導(dǎo)引鋼絲后， 導(dǎo)管連接定標(biāo)后的壓力感受器和MedLab， 自動(dòng)記錄肺動(dòng)脈收縮壓（sPAP）， 肺動(dòng)脈舒張壓（dPAP）和平均肺動(dòng)脈壓（mPAP）。

1.3右心肥大指數(shù)測(cè)定

于小型豬肺動(dòng)脈壓測(cè)完后，采用注射過(guò)量麻醉劑和KCl處死小型豬，取小型豬心臟，稱(chēng)量右心室和左心室加中隔重量，計(jì)算右心肥大指數(shù)即右心室/左心室加中隔重量。同時(shí)比較右心室重量/體質(zhì)量、左心室重量/體質(zhì)量的比值。

1.4肺臟組織病理學(xué)檢測(cè)

取肺組織固定于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛液中，24 h后經(jīng)充分水洗，酒精脫水和二甲苯透明后，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度5 μm。經(jīng)HE染色后做病理組織形態(tài)學(xué)檢查。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

2　結(jié)果

2.1小型豬肺動(dòng)脈壓力測(cè)定

MedLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)實(shí)時(shí)記錄了小型豬右心房、右心室和肺動(dòng)脈壓的壓力波形，保證了肺動(dòng)脈壓力數(shù)據(jù)的真實(shí)可靠， 如圖1、圖2所示壓力波曲線。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組西藏小型豬給藥6周后的sPAP （33.97±1.66 mmHg vs 22.99± 1.70 mmHg， P＜0.01）、dPAP（19.94±2.46 mmHg vs 11.32 ±1.07 mmHg， P＜0.01）都有顯著增加（表1）。模型組的mPAP與對(duì)照組相比也有顯著升高（24.62 ±1.38 mmHg vs 15.10 ±0.76 mmHg， P＜0.01）， 壓力指標(biāo)達(dá)到臨床初級(jí)PH的標(biāo)準(zhǔn)。

2.2右心肥大指數(shù)

對(duì)照組和MCT組小型豬右心肥大指數(shù)即右心室與左心室加中隔重量之比，比值有顯著性差異（0.28±0.13 和0.36±0.16， P＜0.05）。說(shuō)明MCT組的右心肥厚比較明顯， 與肺動(dòng)脈壓力升高相一致。

圖1　西藏小型豬右心房和右心室壓力波曲線（右心房→右心室）Figure 1 The pressure curve of Tibet minipigs at the right atrium and the right ventricle

圖2　西藏小型豬正常肺動(dòng)脈壓力波曲線（右心室→肺動(dòng)脈）Figure 2 Pulmonary artery pressure curve of Tibet minipigs in control group

表1　西藏小型豬給予MCT 6 周后肺動(dòng)脈壓力變化Table 1 Pulmonary artery pressure of pigs at six weeks after MCT injection mmHg

圖3　各組小型豬肺組織形態(tài)學(xué)觀察Figure 3 Morphology of pulmonary tissues of the minipigs （HE staining）

2.3病理學(xué)改變

MCT組肺小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞增生肥大， 血管內(nèi)膜纖維化增厚伴玻璃樣變， 管腔狹窄，閉塞，扭曲變形，呈叢狀改變； 肺小靜脈可見(jiàn)內(nèi)膜纖維性增生和管腔阻塞（圖3A）； 肺小血管重建，肺小動(dòng)脈管壁增厚，有肺小動(dòng)脈閉塞、向心性?xún)?nèi)膜增厚（叢狀血管）的改變（圖3B）； 肺動(dòng)脈血管明顯增厚，狹窄， 部分管壁厚薄不均（圖3C）； 支氣管旁的血管（圖3D），左邊動(dòng)脈血管，管腔狹窄，內(nèi)皮細(xì)胞增生，血管壁明顯增厚，玻璃樣變； 右邊為靜脈管壁，同樣增厚并發(fā)生玻璃樣變從而導(dǎo)致管腔狹窄。

3　討論

MCT屬雙稠吡咯啶生物堿，對(duì)癌細(xì)胞DNA可發(fā)生烴化作用而起到抗癌作用，體內(nèi)注射后主要分布于肝、腎和胃，對(duì)多種實(shí)驗(yàn)性腫瘤有抑制作用。在實(shí)驗(yàn)室MCT廣泛用于PH疾病模型的復(fù)制，以大鼠使用較多［10］； 近年來(lái)兔、羊和犬也都成功地復(fù)制了PH動(dòng)物模型，盡管方法不盡相同，在血流動(dòng)力學(xué)方面與臨床特征均較為接近。但根據(jù)病理分析和后續(xù)的藥物治療研究顯示，與臨床表現(xiàn)和治療情況反差很大［4］，因此探索建立新的與臨床相近的動(dòng)物模型顯得非常必要。豬的肺臟血管床結(jié)構(gòu)、呼吸頻率、潮氣量和體型大小等方面與人類(lèi)極為相似，因此近年來(lái)小型豬也常用于PH模型復(fù)制和研究［11，12］。但僅限于急性模型的復(fù)制，復(fù)制方法包括利用低氧［13］或低壓低氧［14］的方法，以及結(jié)扎單側(cè)肺動(dòng)脈［11］或經(jīng)氣管內(nèi)吸入胎糞法建立急性模型［15］，而且較多使用幼豬（5～10 kg）或新生豬來(lái)建立急性PH模型［16］。

陳洪茂等［5］曾開(kāi)展了利用MCT誘導(dǎo)西藏小型豬建立PH動(dòng)物模型的研究， 效果較好。但所用的是4～5月齡成年小型豬存在一些缺點(diǎn)， 如實(shí)驗(yàn)后期體型相對(duì)偏大，動(dòng)物固定和操作難度大， 用藥量也大，同時(shí)周期偏長(zhǎng)（8周）。為克服以上缺點(diǎn)， 考慮到幼齡動(dòng)物對(duì)藥物的敏感性更高，利用2月齡西藏小型豬來(lái)建立模型，結(jié)果顯示肺動(dòng)脈壓力波形與臨床變化一致， MCT腹腔注射給藥第6周，肺動(dòng)脈壓升高明顯， mPAP由15.10 ± 0.76 mmHg 升至24.62 ± 1.38 mmHg， 可以確定6周時(shí)間即形成PH， 與之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果［9］基本一致， 但實(shí)驗(yàn)周期縮短。

右心肥大指數(shù)顯示， 小型豬給予MCT（12.0 mg/kg）6周后， 實(shí)驗(yàn)組的右心肥大指數(shù)有顯著增加（P＜0.05）。說(shuō)明右心肥厚比較明顯，與肺動(dòng)脈壓力升高的結(jié)果相一致。實(shí)驗(yàn)組小型豬肺臟結(jié)構(gòu)的病理改變，顯示肺臟重構(gòu)情況明顯，除了有肺小動(dòng)脈管腔扭曲變形、狹窄、閉塞以外，也可見(jiàn)到向心性?xún)?nèi)膜增厚（叢狀血管）的改變； 支氣管旁的血管，不僅動(dòng)脈血管有管腔狹窄、內(nèi)皮細(xì)胞增生、血管壁明顯增厚，靜脈管壁同樣增厚并發(fā)生玻璃樣變從而導(dǎo)致管腔狹窄。從病理改變情況可以認(rèn)為該模型的病理變化與人類(lèi)臨床動(dòng)脈性PH的病理改變一致。同時(shí)也驗(yàn)證了幼齡小型豬正處于生長(zhǎng)發(fā)育期，對(duì)于藥物比較敏感，反應(yīng)強(qiáng)烈，結(jié)構(gòu)變化比較快，容易出現(xiàn)病理結(jié)構(gòu)的改變。

利用西藏小型豬建立慢性PH動(dòng)物模型，除指標(biāo)接近臨床特征外，由于其心肺血管結(jié)構(gòu)與人體高度相似，其血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的測(cè)定完全可以利用臨床設(shè)備進(jìn)行， 結(jié)果也與人體最為接近， 同時(shí)作為慢性疾病模型，可以進(jìn)行長(zhǎng)期的觀察和藥物治療研究?？傊?，通過(guò)MCT誘導(dǎo)建立西藏小型豬慢性PH動(dòng)物模型，方法簡(jiǎn)便易行，成功率較高，可以為慢性PH的基礎(chǔ)和臨床研究提供了一個(gè)良好平臺(tái)。

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Establishment of Chronic Pulmonary Hypertension Model in Tibet Minipig

LIU Rong1，2， HOU Meng1，2， LIAO Hai-xing1， ZHANG Xin-feng1， ZHAO Jin1，2， LIU Bao-hua1， QIAN Yuan-xin1，WU Qing-hong3， MO Zi-yao1，2， LIAO Dong-jiang1，2， LI Hong-tao1，2， GU Wei-wang3
（1. Affiliated First Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 510120， China；2. The State Key Laboratory of Respiratory Diseases， Guangzhou Medical University， Guangzhou 510230，China； 3. Laboratory Animal Centre， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China）

Objectives To establish chronic pulmonary hypertension （PH） model with monocrotaline （MCT） in young Tibet minipigs. Methods Twelve Tibet minipigs （weighing 5.0～6.0 kg， aged 2.0 months）were randomly divided into two groups and treated with MCT （12.0 mg/kg） or placebo （75% ethanol）. After six weeks， the pulmonary arterial pressures of the minipigs were measured by performing right heart catheterization （RHC）. The pathologic changes of small pulmonary arteries were observed. Index of right ventricular hypertrophy was also compared between two groups. Results The mean pulmonary arterial pressure by RHC was obviously increased in the MCT group than that in control group （24.62±1.38 mmHg vs 15.10±0.76 mmHg， P＜0.01）. The pathologic observations showed that the pulmonary vascular remodeling and the lumen disappeared in small pulmonary arteries. There was also progressive intimal fibrosis accompany with hyalinization， the lumen was occlusive， twisty and distorted with plexiform lesions. Indexes of right ventricular hypertrophy of MCT group were significantly higher （0.36±0.16 vs 0.28±0.13， P＜0.05）. Conclusions An animal model of chronic PH was established successfully in young minipigs at six weeks after MCT was intraperitoneally injected. The features of the chronic PH model of minipigs are similar with the primary PH parameters.

Pulmonary hypertension； Monocrotaline（MCT）； Tibet minipig； Right heart catheterization

Q95-33

A

1674-5817（2015）06-0431-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.001

2015-06-29

國(guó)家973項(xiàng)目（2011CBA01006）； 廣東省科研基礎(chǔ)條件建設(shè)項(xiàng)目（2012B060300032）

劉蓉（1976-）， 女， 碩士研究生。E-mail： lrong2007@163.com

李洪濤， 男， 醫(yī)學(xué)博士， 教授， 研究方向： 呼吸病理生理學(xué)。 E-mail： gyhongtao@126.com顧為望， 男， 教授， 博士生導(dǎo)師， 研究方向： 比較醫(yī)學(xué)。E-mail： Guww100@163.com