1，25-二羥基維生素D3對鏈脲佐菌素致胰島素瘤細(xì)胞損傷的保護(hù)與修復(fù)作用

何大偉， 倪程佩， 王禹斌， 王　婧， 周正宇

（蘇州大學(xué)實驗動物中心， 蘇州 215123）

1，25-二羥基維生素D3對鏈脲佐菌素致胰島素瘤細(xì)胞損傷的保護(hù)與修復(fù)作用

何大偉， 倪程佩， 王禹斌， 王婧， 周正宇

（蘇州大學(xué)實驗動物中心， 蘇州 215123）

目的 初步探討1，25-二羥基維生素D3（1，25-（OH）2D3）對鏈脲佐菌素（STZ）所致大鼠胰島素瘤（INS-1）細(xì)胞損傷的保護(hù)與修復(fù)作用。方法 將INS-1細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，置于CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，藥物干預(yù)后，應(yīng)用細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK8）檢測細(xì)胞增殖活力，ELISA法分別檢測培養(yǎng)液中的胰島素濃度、丙二醛（MDA）濃度和總抗氧化能力（T-AOC）。結(jié)果 1，25-（OH）2D3可以促進(jìn)INS-1細(xì)胞的活力和胰島素的分泌（P＜0.01）。STZ所致模型組的細(xì)胞活力降低（P＜0.001），胰島素分泌量減少（P＜0.01），MDA含量明顯升高（P＜0.01），T-AOC能力下降（P＜0.01）。與STZ組比較，1， 25-（OH）2D3保護(hù)組與修復(fù)組在不同程度上改善了上述指標(biāo)（P＜0.01）。結(jié)論 1，25-（OH）2D3可以促進(jìn)INS-1細(xì)胞分泌胰島素，對STZ損傷的胰島細(xì)胞具有一定的保護(hù)與修復(fù)作用。

1， 25-二羥基維生素D3（1， 25-（OH）2D3）； 胰島素瘤（INS-1）細(xì)胞； 鏈脲佐菌素（STZ）； 胰島素

隨著世界人口老齡化，糖尿病已成為一種常見病和多發(fā)病，嚴(yán)重危害人類健康。近年來，隨著人們對維生素D的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)維生素D缺乏與Ⅰ型糖尿病及Ⅱ型糖尿病有一定聯(lián)系， 長期補充維生素D可以降低這些疾病發(fā)生的風(fēng)險［1-3］，但具體作用機制尚未闡明。大鼠胰島素瘤（INS-1）細(xì)胞是一種來自大鼠胰島素瘤的細(xì)胞株，可以穩(wěn)定地分泌胰島素，是研究胰島細(xì)胞功能的理想細(xì)胞［4］。本實驗應(yīng)用維生素D的活性形式1， 25-二羥基維生素D3（1， 25-（OH）2D3），觀察其對鏈脲佐菌素（STZ）致INS-1細(xì)胞損傷的保護(hù)和修復(fù)作用，并初步探討其作用機制，為維生素D預(yù)防和治療糖尿病提供一定的實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

INS-1細(xì)胞， 購自上海拜利生物科技有限公司；1， 25-（OH）2D3、鏈脲佐菌素（STZ）和β-巰基乙醇均購自Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶均購自Gibco公司，大鼠胰島素檢測試劑盒、丙二醇（MDA）和總抗氧化（T-AOC）試劑盒均購自上海滬尚生物科技有限公司，細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK8）購自DOJINDO公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)使用含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，1 mmol/L丙酮酸鈉，50 μmol/L β-巰基乙醇， 1×105IU/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)INS-1細(xì)胞。從液氮取出凍存的細(xì)胞迅速放入37 ℃恒溫水浴鍋，快速搖晃凍存管使之在2 min內(nèi)融化。然后，用酒精棉球擦拭凍存管外周后拿進(jìn)超凈臺，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至含有4 mL 1640完全培養(yǎng)基的15 mL離心管中，1 000 r/min，離心5 min后，棄上清，加入10 mL 1640完全培養(yǎng)基混勻后，轉(zhuǎn)移到直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中， 并置于37℃， 5% CO2飽和濕度的恒溫箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞狀態(tài)， 每2 d換液一次，待細(xì)胞長至60%～80%時，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗2次， 加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化1 min后， 加完全培養(yǎng)基終止消化， 將細(xì)胞懸液以1 000 r/min，離心5 min后，按1∶3進(jìn)行傳代。

1.2.2CCK8檢測細(xì)胞活力將濃度7×105個/mL 的INS-1細(xì)胞接種至96孔板，100 μL/孔，每組6個重復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后進(jìn)行藥物干預(yù)，待藥物干預(yù)結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK8，孵育1～3 h后，用全自動酶標(biāo)儀測450 nm波長時各孔的D值。

1.2.3葡萄糖刺激的胰島素分泌（GSIS）棄去培養(yǎng)液， 用PBS洗滌各組細(xì)胞2次， 加入含2.8 mmol/L葡萄糖的克-林二氏重碳酸鹽（KRB）緩沖液孵育1 h，再更換為含有20 mmol/L葡萄糖的KRB緩沖液孵育1 h后，收集上清。胰島素分泌水平的測定根據(jù)ELISA檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，最后計算出胰島素在高糖刺激后的分泌水平與基礎(chǔ)狀態(tài)分泌水平的比值。

1.2.4不同濃度的1，25-（OH）2D3對INS-1細(xì)胞的胰島素分泌和細(xì)胞活性的影響將濃度7×105個/mL 的INS-1細(xì)胞隨機分為正常對照組、1，25-（OH）2D3組（包含10-6mmol/L組、10-7mmol/L組、10-8mmol/L組、10-9mmol/L組）分別接種于24孔板和96孔板，每組6個重復(fù)孔，待細(xì)胞完全貼壁后，加入不同濃度的1，25-（OH）2D3，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，分別測定GSIS和細(xì)胞活力。

1.2.51，25-（OH）2D3對STZ致INS-1細(xì)胞損傷的影響使用上述方法將INS-1接種培養(yǎng)板， 并隨機分為正常對照組、STZ 5 mmol/L組、保護(hù)組［1，25-（OH）2D3 10-7mmol/L+STZ 5 mmol/L］、修復(fù)組（STZ 5 mmol/L+ 1，25-（OH）2D310-7mmol/L）， 每組6個重復(fù)孔。待細(xì)胞完全貼壁后， 保護(hù)組先加入濃度為10-7mmol/L 1，25-（OH）2D3培養(yǎng)24 h，再加入5 mmol/L的STZ培養(yǎng)3 h； 修復(fù)組先加入5 mmol/L的STZ作用3 h后，再加入濃度為10-7mmol/L 1， 25-（OH）2D3培養(yǎng)24 h； STZ組加入5 mmol/L的STZ作用3 h。干預(yù)結(jié)束后，分別測定各組胰島素的分泌水平和細(xì)胞活力， MDA的生成和T-AOC能力的檢測根據(jù)ELISA檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。每組實驗都獨立重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2.1不同濃度的1，25-（OH）2D3對INS-1細(xì)胞胰島素分泌和細(xì)胞活性的影響

基礎(chǔ)葡萄糖狀態(tài)下， 各組細(xì)胞分泌的胰島素水平和細(xì)胞活性無顯著差異， 高糖狀態(tài)下， 10-7mmol/L 的1，25-（OH）2D3處理組的INS-1細(xì)胞分泌的胰島素水平明顯增加（P＜0.01）（表1）； 且10-7mmol/L組的INS-1細(xì)胞活性最高（P＜0.01）（表2）。

2.21，25-（OH）2D3對STZ致INS-1細(xì)胞損傷的影響

基礎(chǔ)和高糖狀態(tài)下， STZ組的INS-1細(xì)胞分泌的胰島素水平和細(xì)胞活性明顯低于正常對照組；而保護(hù)組和修復(fù)組的INS-1細(xì)胞分泌的胰島素水平和細(xì)胞活性較STZ組有明顯的增加（表3， 表4）。與正常對照組相比， STZ組的MDA生成量升高， T-AOC能力下降； 而與STZ組相比， 保護(hù)組和修復(fù)組的MDA生成量明顯下降，T-AOC能力顯著升高（表5）。

表1　不同濃度的1，25-（OH）2D3對INS-1細(xì)胞胰島素分泌的影響Table 1 Effects of different concentrations of 1，25-（OH）2D3 on insulin secretion of INS-1 cells

表2　不同濃度的1，25-（OH）2D3對INS-1細(xì)胞活性的影響Table 2 Effects of different concentrations of 1，25-（OH）2D3 on cell viability of INS-1 cells

表3　1，25-（OH）2D3對STZ致INS-1細(xì)胞損傷的胰島素分泌的影響Table 3 Effects of 1，25-（OH）2D3 on insulin secretion of INS-1 cells damaged by STZ

表4　1， 25-（OH）2D3對STZ致INS-1細(xì)胞損傷的細(xì)胞活性的影響Table 4 Effects of 1， 25-（OH）2D3 on cell viability of INS-1 cells damaged by STZ

表5　1，25-（OH）2D3對INS-1細(xì)胞MDA生成和T-AOC能力的影響Table 5 Effects of 1，25-（OH）2D3 on the production of MDA and capacity of T-AOC of INS-1 cells

3　討論

維生素D除其傳統(tǒng)作用外，越來越多的新功能已被人們認(rèn)知。缺乏維生素D不僅影響免疫系統(tǒng)，還可以導(dǎo)致胰島細(xì)胞功能紊亂； 重度佝僂病患者體內(nèi)的胰島素合成明顯減少，表現(xiàn)為明顯的胰島素缺乏癥［5］。維生素D在葡萄糖/胰島素代謝中發(fā)揮著重要作用［6］，是維持胰島結(jié)構(gòu)和功能正常所必不可少的因素［7］， 本實驗結(jié)果進(jìn)一步證實了此觀點。

氧化應(yīng)激（oxidative stress）是指機體組織或細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成增加或清除能力下降，導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積而引起的氧化損傷過程［8］。ROS會攻擊生物膜不飽和脂肪酸形成脂質(zhì)過氧化物，其產(chǎn)物MDA是一種有害物質(zhì)，可作為評價脂質(zhì)過氧化反應(yīng)強弱的指標(biāo)［9］； T-AOC是反應(yīng)組織抗氧化能力的重要指標(biāo)之一。與其他組織細(xì)胞相比，胰島細(xì)胞缺乏抗氧化酶類，易受氧化應(yīng)激損傷［10，11］，抗氧化能力較弱，對活性氧更加敏感。胰島細(xì)胞損傷和功能異常是糖尿病發(fā)生的主要原因。ROS可以損傷胰島細(xì)胞的細(xì)胞核和線粒體，導(dǎo)致胰島素分泌水平下降，細(xì)胞凋亡增加［12］。而STZ可以直接產(chǎn)生ROS，被廣泛用于制作糖尿病模型［13］。越來越多的研究結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。本實驗結(jié)果顯示，STZ損傷組的細(xì)胞活力和胰島素分泌都明顯受到抑制，同時MDA顯著上升，T-AOC明顯下降； 與STZ組比較，保護(hù)組和修復(fù)組的細(xì)胞活力和胰島素分泌水平均上升，細(xì)胞活性升高，而MDA水平下降，T-AOC水平上升，結(jié)果表明1，25-（OH）2D3能有效的保護(hù)和修復(fù)STZ引起的胰島細(xì)胞損傷，恢復(fù)胰島細(xì)胞的功能，其機制可能是通過抑制脂質(zhì)過氧化物的生成，提高細(xì)胞的總抗氧化能力。

維生素D對于糖尿病的影響機制目前尚未完全闡明，本實驗結(jié)果表明1，25-（OH）2D3可以在體外試驗中提高胰島細(xì)胞的活力、促進(jìn)胰島素分泌和改善氧化應(yīng)激作用，但仍需要更多的動物體內(nèi)實驗和相關(guān)的臨床研究進(jìn)行驗證。

［1］張黎明， 龍艷， 蘇珂. 維生素D與糖尿病［J］. 廣東醫(yī)學(xué)， 2013，34（8）：1300-1302.

［2］Wolden-Kirk H， Overbergh L， Christen HT， et al. Vitamin Dand diabetes： its importance for beta cell and immune function ［J］. Mol Cell Endocrinol， 2011， 347（1/2）：106-120.

［3］Kurt O， Balta S， Cakar M， et al. The protectiveness of the treatment of vitamin D insufficiency in the development of diabetes［J］. Arq Bras Endocrinol Metabol， 2013， 57：157-8.

［4］Xu GL， Chen JQ， Gu J， et al. Preventing β-Cell Loss and Diabetes With Calcium Channel Blockers［J］. Diabetes， 2012，61（4）：848-856.

［5］Giulietti A， Gysemans C， Stoffels K， et al. Vitamin D deficiency in early life accelerates Type 1 diabetesin non-obese diabetic mice［J］. Diabetologia， 2004， 47（3）：451-462.

［6］Holick MF. The D-lightful vitamin D for child health［J］. JPEN J Parenter Enterai Nutr， 2012， 36（1 suppl）：9S-19S.

［7］Afzal S， Brondum-Jacobsen P， Bojesen SE， et al. Vitamin D concentration， obesity， and risk of diabetes： a mendelian randomisation study［J］. Lancet Diabetes Endocrinol， 2014，2（4）： 298-306.

［8］宋影芳， 賴國祥， 戚好文， 等. 1，25-二羥基維生素D3減輕哮喘小鼠的氣道重塑［J］. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床， 2011， 31（9）：1021-1025.

［9］Kaneto H， Nakatani Y， Kawamori D， et al. Role of oxidative stress， endoplasmic reticulum stress， and c-Jun N-terminal kinase in pancreatic beta-cell dysfunction and insulin resistance ［J］. Int J Biochem Cell Biol， 2006， 38（5-6）：782-793.

［10］ Maiese K， Morhan SD， Chong ZZ. Oxidative stress biology and cell injury during type 1 and type 2 diabetes mellitus［J］. Curr Neurovasc Res， 2007， 4（1）：63-71.

［11］ Du SC， Ge QM， Lin N， et al. ROS-mediated lipopolysaccharide-induced apoptosis in INS-1 cells by modulation of Bcl-2 and Bax［J］. Cell Mol Biol （Noisy-le-grand）， 2012， 58 Suppl：OL1654-1659.

［12］ Miyazaki Y， Kawano H， Yoshida T， et al. Pancreatic B-cell function is altered by oxidative stress induced by acute hyperglycaemia［J］. Diabet Med， 2007， 24（2）：154-160.

［13］ 金經(jīng)， 羅佐杰. 氧化應(yīng)激對胰島β細(xì)胞影響的研究進(jìn)展［J］. 山東醫(yī)藥， 2009， 49（37）：108-109.

Protective and Repairing Effects of 1，25 - dihydroxy Vitamin D3 on STZ induced INS-1 Cells Damage

HE Da-wei， NI Cheng-pei， WANG Yu-bin， WANG Jing， ZHOU Zheng-yu
（Laboratory Animal Center of Soochow University， Suzhou 215123， China）

Objective To explore the protection and repair effects of 1，25-dihydroxyvitamin D3 on STZ-induced INS-1 cells damage. Methods After inoculating the INS-1 cells into the culture plates，the proliferation activity of the cells was measured by CCK8 method. Secreted insulin and malondialdehyde （MDA） concentration， total anti-oxidation capability （T-AOC） in the culture medium were measured by ELISA. Results 1，25-dihydroxyvitamin D3 improved the viability and insulin secretion of the INS-1 cells（P＜0.01）. The cell proliferation （P＜0.001）， insulin secretion （P＜0.01） and T-AOC （P＜0.01） of the STZ group decreased， and the MDA content （P＜0.01） significantly increased Compared with the STZ group， the protection and repairation group of 1，25-dihydroxyvitamin D3 can improve the above index in different degrees（P＜0.01）. Conclusions 1，25-dihydroxy vitamin D3 improved the insulin secretion of the INS-1 cells and had significantly protection and repair effects on the INS-1 cells damaged by STZ.

1，25-dihydroxyvitamin D3； Insulinoma （INS-1） cells； Streptozotocin （STZ）； Insulin

Q95-33

A

1674-5817（2015）06-0458-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.006

2015-03-15

江蘇省自然科學(xué)基金（BK20151217）

何大偉（1987-）， 男， 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部2012級碩士研究生。E-mail： 645836427@qq.com

周正宇（1973-）， 男， 副教授， 主要從事比較醫(yī)學(xué)研究。E-mail： zacharyzhou@suda.edu.cn