長爪沙鼠淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒抗體ELISA檢測方法的建立與應用

王　吉， 衛(wèi)　禮， 付　瑞， 李曉波， 王淑菁， 邢　進， 馮育芳， 鞏　薇， 岳秉飛， 賀爭鳴

（中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所、國家實驗動物微生物、遺傳檢測中心， 北京 100050）

長爪沙鼠淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒抗體ELISA檢測方法的建立與應用

王吉， 衛(wèi)禮， 付瑞， 李曉波， 王淑菁， 邢進， 馮育芳， 鞏薇， 岳秉飛， 賀爭鳴

（中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所、國家實驗動物微生物、遺傳檢測中心， 北京 100050）

目的 建立長爪沙鼠淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒（LCMV）抗體ELISA檢測方法， 應用于長爪沙鼠攜帶LCMV的檢測。方法 培養(yǎng)Vero細胞，接種LCMV毒種，制備Vero正?？乖蚅CMV特異抗原，滴定酶結合物、正?？乖疤禺惪乖罴压ぷ鳚舛?，并進行方法的特異度、靈敏度、精密性、穩(wěn)定性實驗。結果 正?？乖?、特異抗原和酶結合物最佳工作濃度分別為0.4 μg/mL、10 μg/mL和1∶5 000； 正常抗原、特異抗原批內(nèi)變異系數(shù)分別為6.8%和8.9%，批間平均變異系數(shù)分別為9.3%和8.4%； 檢測靈敏度達到1∶1 280； 與小鼠仙臺病毒（SV）、小鼠呼腸孤病毒3型（Reo3）均無交叉反應。穩(wěn)定性試驗相對偏差小于25%。結論 建立的ELISA方法特異度、靈敏度強，重復性、穩(wěn)定性好，可用于長爪沙鼠LCMV抗體的檢測。

淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒（LCMV）； ELISA； 長爪沙鼠

長爪沙鼠又稱蒙古沙鼠（Meriones unguiculatus；Mongolian gerbil），分類學上屬于嚙齒目、倉鼠科、沙鼠亞科、沙鼠屬，產(chǎn)于我國內(nèi)蒙、河北、山西、甘肅等地，是一種正在開發(fā)、有著廣闊應用前景的多功能實驗動物［1-5］。國內(nèi)外大量研究資料表明，長爪沙鼠具有多方面獨特的生物學特性，已被廣泛應用于醫(yī)學、生物學、行為學等生物學領域［1-5］，而且由于長爪沙鼠的乳鼠對流行性出血熱病毒的易感性，一直用作流行性出血熱疫苗的研究及生產(chǎn)［2，4，5］。應賢平等［6］和段明麗等［7］經(jīng)實驗證實屏障系統(tǒng)長爪沙鼠、開放飼養(yǎng)的長爪沙鼠和野生長爪沙鼠對淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒均易感。

淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒（LCMV）屬于沙粒病毒科（Arenaviridae），沙粒病毒屬（Arenavirus）。是一種由鼠類攜帶的人獸共患病毒，自然儲存宿主主要有小鼠和地鼠［8-11］。大鼠、豚鼠、倉鼠、犬、猴、雞、馬、兔和棉鼠均易感［8］。LCMV在全球分布廣泛，在北美、南美、亞洲和歐洲均有流行的報道。我國也有LCMV感染人和鼠的報道［8］。動物感染臨床主要表現(xiàn)精神呆滯、嗜睡、被毛粗亂、弓背、消瘦、生長緩慢、驚厥和結膜炎等癥狀，嚴重影響實驗和生產(chǎn)，而且會給飼養(yǎng)人員和實驗人員帶來潛在感染的危險［8，12-14］。人類主要由于接觸攜帶病毒的鼠類排泄物而引起感染，臨床主要表現(xiàn)流感樣癥狀和腦膜炎，嚴重者會留下神經(jīng)后遺癥甚至死亡［8，12-14］。

本文旨在建立長爪沙鼠淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒抗體ELISA方法，為保證長爪沙鼠的安全使用及標準化研究提供檢測技術手段。

1　材料與方法

1.1主要材料

LCMV毒種、Vero細胞： 本室凍存； 兔抗沙鼠IgG-HRP： GeneTex公司產(chǎn)品； 長爪沙鼠LCMV、仙臺病毒（SV）、呼腸孤病毒3型（Reo3）、小鼠肝炎病毒（MHV）、小鼠腦脊髓炎病毒（TMEV）標準陰、陽對照血清：浙江省實驗動物質(zhì)量檢測中心提供；63 只開放環(huán)境飼養(yǎng)的長爪沙鼠，20只經(jīng)凈化屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)的長爪沙鼠，均來源于首都醫(yī)科大學實驗動物科學部［SCXK（京）2013-0006］； 22只開放環(huán)境飼養(yǎng)的長爪沙鼠，來源于浙江省實驗動物中心［SCXK（浙）2014-0001］。所有實驗用的動物均按3R原則給予人道關懷。

1.2主要儀器

酶標儀： ThermoMULTISKAN MK3； 37 ℃水浴箱： 上海森信實驗儀器有限公司 DK-4500B型； 37 ℃培養(yǎng)箱： WGP-600。

1.3方法

1.3.1病毒感染力滴度（TCID50）測定將LCMV病毒液以10-1～10-11作系列倍比稀釋，依次加入培養(yǎng)有Vero細胞的96孔細胞培養(yǎng)板（costor）（1～11列）， 每個稀釋度接種1列（8孔）， 第12列不加病毒， 作為細胞對照。置37 ℃培養(yǎng)觀察10 d， 記錄結果［5，15-17］。

1.3.2抗原的制備及純化正?？乖?Vero細胞長滿單層， 常規(guī)消化， 用PBS洗滌， 4 ℃ 1 000 r/min離心10 min， 將離心沉淀溶于適量PBS 凍融3次后，超聲破碎，4 ℃ 10 000 r/min離心30 min， 取上清，測定蛋白含量［5，15-17］。

特異抗原： 收獲LCMV細胞毒于4 ℃， 10 000 r/min離心1 h， 取上清于4 ℃， 40 000 r/min離心3 h， 收集沉淀于適量PBS中［5，15-17］。再經(jīng)質(zhì)量分數(shù)20%蔗糖離心后， 用紫外分光光度法測定抗原蛋白含量［5，15-17］。

1.3.3判斷標準的確定依據(jù)國標選擇D490來讀取吸光度。在陰、陽對照血清成立的情況下，待檢血清特異抗原孔D值≥0.2、待檢血清特異抗原孔D值/陰性對照特異抗原孔D值≥2.1， 判為陽性。否則判為陰性。待檢血清處于臨界值（D值=0.2± 0.01，D值變化率≤5%），同時待檢血清特異抗原孔D值/陰性對照特異抗原孔D值≥2.1時，需要復檢。復檢結果與初檢結果一致，則按初檢結果進行判定；復檢結果與初檢結果不一致，則需要二次復檢，二次復檢結果符合陽性結果判定標準，則結果判為陽性，二次復檢結果符合陰性結果判定標準，則結果判為陰性［18］。

1.3.4正?？乖c特異抗原、酶結合物最佳工作濃度的確定將陰、陽對照血清和待檢血清1∶40稀釋［5，15-18］。正?？乖謩e以0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、 0.2 μg/mL、0.4 μg/mL進行包被，特異抗原分別以5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL進行包被，羊抗沙鼠IgG-HRP以1∶5 000～1∶64 000倍比稀釋，采用方陣滴定法確定正?？乖?、特異抗原和酶結合物最佳工作［5，15-17］。

1.3.5特異度試驗用已建立的ELISA法分別檢測沙鼠SV、Reo3、MHV、TMEV陰性血清和陽性血清，同時設沙鼠LCMV標準陰性血清和陽性血清對照［5，15-17］。

1.3.6穩(wěn)定性試驗將4 ℃放置0 d、30 d和90 d 的3個不同批次抗原包被板，同時檢測已知4份陰性血清和4份陽性血清，計算D490變化率（相對偏差），確定ELISA法的穩(wěn)定性［5，15-17］。

1.3.7精密性試驗同一份陽性血清的同一稀釋度用同一批板同時做20孔， 計算D490的變異系數(shù)［5，15-17］。

將4 ℃放置0 d、30 d、60 d和90 d的4個不同批次抗原包被板，同時檢測不同抗體水平的同8份陰性血清和同8份陽性血清，進行批間重復性試驗，計算批間平均變異系數(shù)［5，15-17］。

1.3.8靈敏度試驗LCMV抗體陽性血清從1∶40開始作系列倍比稀釋，用建立的ELISA法進行檢測，最大稀釋比例陽性孔（D490≥0.2）為其檢測靈敏度［5，15-17］。

1.3.9初步應用用建立的ELISA方法， 檢測63份普通環(huán)境飼養(yǎng)的長爪沙鼠血清、42份經(jīng)凈化的長爪沙鼠血清。

1.3.10可信度用XpressBio公司商品化LCMV抗體ELISA檢測試劑，檢測63份普通環(huán)境飼養(yǎng)的長爪沙鼠血清和42份經(jīng)凈化的長爪沙鼠血清，驗證實驗所建立ELISA方法的可信度［5，15-17，19-20］。

2　結果

2.1病毒感染力滴度

LCMV病毒感染力滴度為7.25 lgTCID50/mL。

2.2抗原濃度測定

Vero正?？乖鞍缀繛椋?1.264 mg/mL； 特異抗原LCMV蛋白含量分為5.732 mg/mL。

2.3最佳工作條件確定

正?？乖?、特異抗原和兔抗沙鼠IgG-HRP最佳工作濃度分別為0.4 μg/mL、10 μg/mL和1∶5 000。

2.4特異度

在LCMV陰性對照血清和陽對照血清均成立的條件下，與SV、Reo3、MHV和TMEV陰性對照血清、陽性血清均無特異性反應（表1）。

2.5穩(wěn)定性

8份血清經(jīng)穩(wěn)定性實驗檢測A值變化率（相對偏差）均小于25%（表2）。

2.6精密性

2.6.1批內(nèi)變異系數(shù)測定通過同一份血清同時檢測20個復孔的測定結果，得出正?？乖吞禺惪乖鷥?nèi)變異系數(shù)分別為6.8%和8.9%（表3）。

根據(jù)不同時間檢測16份血清D490變化率，得出正?？乖?、特異抗原的批間平均變異系數(shù)（CV）分別為9.3%和8.4%。

表1　ELISA方法特異度試驗Table 1 Detection results of the specificity of ELISA

表2　ELISA方法穩(wěn)定性試驗測定Table 2 Detection results of the stability of ELISA

表3　ELISA方法批內(nèi)變異系數(shù)測定Table 3 Detection results of the batch variation coefficien of ELISA

2.7靈敏度

通過對不同稀釋度的陽性對照的檢測，得出檢測方法的靈敏度為1∶1 280（表4）。

2.8初步應用

用已建立的ELISA方法檢測63份普通環(huán)境飼養(yǎng)的長爪沙鼠血清， LCMV抗體陽性率為6.3%（4/63）；檢測首都醫(yī)科大學20份經(jīng)凈化的長爪沙鼠血清和浙江實驗動物質(zhì)量檢測中心開放環(huán)境飼養(yǎng)的22份長爪沙鼠血清，抗體均為陰性。

2.9可信度測定

用XpressBio公司檢測試劑檢測LCMV抗體陰性的101份血清，結果均為陰性，檢測LCMV抗體陽性的4份血清，結果均為陽性。檢測結果符合率為100%。

表4　間接ELISA方法靈敏度測定（D490）Table 4 Detection results of the sensivity of ELISA

3　討論

LCMV廣泛存在于世界各地的鼠群中，在自然條件下僅感染嚙齒類動物中的鼠科和倉鼠科動物，長爪沙鼠在分類學上屬于嚙齒目、倉鼠科， 是LCMV在自然條件下可感染的倉鼠科動物之一［8］。應賢平等［6］經(jīng)血清學檢測屏障系統(tǒng)長爪沙鼠和開放飼養(yǎng)的長爪沙鼠LCMV抗體陽性率分別為1.3%和6.0%，段明麗等［7］檢測我國內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)野生長爪沙鼠抗體陽性率為13.3%。而且LCMV是人獸共患病，動物一旦感染，不僅會影響生產(chǎn)和實驗，還會對飼養(yǎng)和實驗人員帶來潛在危險，另外LCMV可經(jīng)胎盤垂直傳播，給動物的凈化增加了困難［8］。因此，LCMV感染也是實驗長爪沙鼠標準化研究中亟需解決的問題之一。ELISA方法具有微量、特異、高效、經(jīng)濟、方便、安全和結果客觀等特點，廣泛應用于生物學和醫(yī)學的許多領域，在理論研究和實際工作中都發(fā)揮了重要作用［21］。本實驗建立了長爪沙鼠LCMV抗體ELISA方法，為沙鼠的凈化提供檢測手段。

試驗用Vero細胞培養(yǎng)LCMV作抗原，雖經(jīng)過蔗糖純化，但也會存在細胞類等非特異性物質(zhì)，為排除細胞類等物質(zhì)可能引起的非特異性反應，同時用處理過的Vero細胞作正?？乖瓕φ?，可以有效排除非特異性反應而造成的假陽性，提高了檢測結果的特異性和準確性［5，15-17］。ELISA方法的批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%，批間平均變異系數(shù)均小于15%， 說明精密性良好［5，15-17］； 靈敏度達到1∶1 280，說明敏感性較高［5，15-17］； 特異度試驗顯示，與小鼠仙臺病毒和小鼠呼腸孤病毒3型均無免疫交叉反應，證明ELISA方法的特異度令人滿意［5，15-17］。

用建立的ELISA方法檢測63份普通環(huán)境飼養(yǎng)的長爪沙鼠血清，結果顯示， 抗體陽性率為6.3%，與文獻報道［6］的開放飼養(yǎng)長爪沙鼠LCMV抗體陽性率（6.0%）基本相符。說明開放飼養(yǎng)的沙鼠確實攜帶LCMV。檢測首都醫(yī)科大學20只經(jīng)凈化長爪沙鼠和浙江省實驗動物中心22只凈化長爪沙鼠，抗體檢測結果均為陰性。說明經(jīng)過凈化的沙鼠群LCMV感染率降低。本實驗結果只能說明這兩個不同地區(qū)凈化沙鼠群的感染情況，如果確切了解凈化后的沙鼠群是否攜帶LCMV，還需擴大檢測樣本量，或長期跟蹤檢測?？尚哦仍囼炛?， 用XpressBio公司檢測試劑檢測同一批105份血清， 有101份陰性，4份陽性，兩種方法檢測結果的符合率為100%，說明建立的ELISA法靈敏度高、準確性好［5，15-17］。

雖然早在1995年就建立了長爪沙鼠MHV ELISA檢測方法［6］， 且當時已應用于長爪沙鼠的檢測，但該方法是通過肉眼觀察判斷結果，在檢測結果判斷上主觀性比較強，且此方法并沒有推廣［5，7，15-17］。本次試驗建立的長爪沙鼠LCMV ELISA檢測方法的檢測結果是通過儀器（酶標儀： Thermo MULTISKAN MK3）進行檢測， 因此檢測結果更加客觀可靠［5，15-17］。段明麗等［7］在2013年用ELISA方法對長爪沙鼠進行了LCMV的檢測，使用的檢測抗原來源于本實驗室。作者在用本實驗室抗原作為檢測抗原的基礎上，對方法的特異度、靈敏度、穩(wěn)定性、精密性等均作了充分的驗證，還通過與國外商品化檢測試劑進行比較，來驗證所建立的檢測方法的準確性和可信度［17］。

作者建立的長爪沙鼠LCMV抗體ELISA檢測方法特異、敏感、穩(wěn)定，精密性好、檢測準確性高，操作快速、簡便、易于推廣，為長爪沙鼠LCMV抗體檢測試劑盒的研制及開展沙鼠LCMV的檢測工作和質(zhì)量標準的制定奠定了基礎。

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Establishment and Preliminary Application of ELISA in Detecting Lymphocytic Choriomeningitis Virus Antibody in Mongolian Gerbil

WANG Ji， WEI Li， FU Rui， LI Xiao-bo， WANG Shu-jing， XING Jin，F(xiàn)ENG Yu-fang， GONG Wei， YUE Bing-fei， HE Zheng-ming
（National Institutes for Food and Drug Control， National Center for Quality of Laboratory Animal， Beijing 100050， China）

Objective To develope the ELISA method for determination of lymphocytic choriomeningitis virus （LCMV） antibody in Mongolian gerbils. Methods Raised the Vero cell， vaccinated the LCMV， prepared the normal Vero antigen and specific LCMV antigen， titrated the best working density of enzyme union， the normal and specific antigen and verified the specificity， sensitivity， accuracy and stability of the method. Result The best working density of normal， specific antigen and the enzyme union were 0.4 μg/mL， 10 μg/mL and 1∶5 000， respectively. The inter-assay coefficient of variation of normal antigen and specific antigen were 6.8% and 8.9%， respectively， the intra-assay average coefficient of variation were 9.3% and 8.4%， respectively. The detection sensitivity was 1∶1 280. There was no cross-reactivity with mammalian orthoreovirus 3 （Reo3） and murine encephalomyelitis virus （M-TMEV）. The stability test shows the relative deviation was below 25%. Conclusion The ELISA method is good in specificity， sensitivity， duplication， and stability， so ELISA could be used in detecting the LCMV antibody.

Lymphocytic choriomeningitis virus （LCMV）；ELISA； Mongolian gerbil

Q95-33

A

1674-5817（2015）06-0473-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.009

2015-06-15

國家科技支撐計劃項目（2013BAK11B01）

王吉（1974-）， 女， 副研究員， 研究方向： 微生物學和免疫學。E-mail： wj_nd_jds@sina.com

賀爭鳴（1957-）， 博士， 男， 研究員，研究方向： 微生物學和免疫學。E-mail： zhengminghe57@163.com