不同基因型南荻愈傷組織誘導(dǎo)及分化的差異

彭思佳，肖 亮，劉清波，易自力，蔣建雄,2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院芒屬植物研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.江蘇大學(xué)生物質(zhì)能源研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

礦物能源短缺和環(huán)境污染是人類面臨的兩大危機(jī)，可再生性生物質(zhì)能源的開發(fā)利用正成為世界關(guān)注的焦點(diǎn)，能源植物與化石能源相比更具有安全環(huán)保性，木質(zhì)纖維類能源植物相對(duì)眾多的能源植物開發(fā)前景更為可觀[1]。芒屬（M iscanthus）植物是一類多年生C4高大草本纖維類植物，廣泛分布于東亞，且以我國(guó)為遺傳多樣性中心，主要種類有芒（M. sinensis）、五節(jié)芒（M. floridulus）、荻（M. sacchariflorus）和南荻（M. lutarioriparius）等[2]，其中南荻為我國(guó)特有種[3]。南荻具有生物產(chǎn)量高、纖維品質(zhì)好、根系發(fā)達(dá)、種植成本低和適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，不僅可以直接燃燒產(chǎn)生能量和作為生物乙醇原料，也可以作為造紙?jiān)虾惋暳?，還可以防風(fēng)固土[4]，因此，南荻兼具經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效益，大規(guī)模種植具有重要意義。

南荻高度自交不親和，以無性繁殖為主，有性繁殖為輔，長(zhǎng)期的無性繁殖會(huì)導(dǎo)致種性退化甚至嚴(yán)重病毒積累，雜交會(huì)導(dǎo)致后代變異增大，不利于品種優(yōu)良品質(zhì)的保存，而組織培養(yǎng)技術(shù)不僅可以保持種質(zhì)的優(yōu)良特性狀，也是進(jìn)行品種改良的基礎(chǔ)。因此，開展組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)南荻開發(fā)利用至關(guān)重要。目前，不少研究者對(duì)南荻離體培養(yǎng)多方面進(jìn)行了研究，如外植體、基本培養(yǎng)基、激素配比、移栽條件等，旨在建立高效的再生體系[5-7]，而關(guān)于基因型對(duì)再生能力的影響尚無報(bào)道?；蛐褪菍?dǎo)致再生頻率差異的重要內(nèi)在因素，對(duì)離體培養(yǎng)存在影響已在玉米[8]、苧麻[9]、奇崗[10]和芒[11]等材料上得到證明。試驗(yàn)以采自不同地區(qū)的南荻為試驗(yàn)材料，探究不同基因型南荻再生能力與莖稈成分之間的關(guān)系，旨在篩選再生頻率高的材料作為組織培養(yǎng)的優(yōu)良供體，為進(jìn)一步完善南荻遺傳轉(zhuǎn)化體系、多倍體誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以采集于全國(guó)各地的野生南荻種質(zhì)資源為試驗(yàn)材料，現(xiàn)保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬能源植物資源圃，試材具體信息見表1。

表1 供試植物材料的基本信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別配制愈傷組織誘導(dǎo)、繼代和分化培養(yǎng)基，pH 值均調(diào)至5.8[12]。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L 6-BA+0.2 g/L 檸檬酸+30 g/L 蔗糖+8 g/L 瓊脂粉；愈傷組織繼代培養(yǎng)基：MS+2 mg/L 2,4-D+30 g/L 蔗糖+8 g/L 瓊脂粉；分化培養(yǎng)基：MS+2.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 水解酪蛋白+30 g/L 蔗糖+8 g/L 瓊脂粉。

1.2.2 離體組織培養(yǎng) 采取穎花原基形成時(shí)期（旗葉抽出不久）大小一致的幼穗，4℃保存24 h，取出后剝?nèi)ト~鞘和外層苞葉，用75%乙醇進(jìn)行表面消毒，在超凈工作臺(tái)上用0.1%升汞滅菌10 min 后，用無菌水沖洗4～5 次[13-15]，放置于無菌濾紙上吸干外植體表面水分，剝出幼穗并剪切成1 cm 左右長(zhǎng)段。

將幼穗段接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，25±1℃暗培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織塊數(shù)。切下胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接入繼代培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)15 d 后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織塊數(shù)。

挑取胚性愈傷組織接入分化培養(yǎng)基中，置于25±1℃、14 h/d、光照強(qiáng)度1 500～2 500 lx 的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，30 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的植株分化率。

1.2.3 莖稈化學(xué)成分測(cè)定 各基因型隨機(jī)取5個(gè)莖稈，經(jīng)45℃烘干粉碎、過40 目篩，密封儲(chǔ)存?zhèn)溆?。采用中性洗滌劑和酸性洗滌劑法測(cè)定半纖維素含量，采用72%濃硫酸水解和灰化法測(cè)定纖維素和Klason 木質(zhì)素含量，采用直接灰化法測(cè)定總灰分含量，105℃直接干燥法測(cè)定含水量[16]。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 對(duì)不同基因型南荻的再生過程進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)。按公式（1）、（2）、（3）計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率、胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和胚性愈傷組織分化率。重復(fù)10 次。

采用Excel 2007 和DPS 7.05 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、多重比較和回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型的愈傷組織誘導(dǎo)和植株分化能力比較

在幼穗在接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，B9 幼穗于第7 d兩端產(chǎn)生愈傷組織；C2、A6 和A2 幼穗兩端在第9 d產(chǎn)生愈傷組織，A4 和C4 的在第10 d 產(chǎn)生愈傷組織；A9 和A1 在第12 d 產(chǎn)生愈傷組織。愈傷組織顏色主要是淡黃色、紫色、黃色、褐色，分為胚性愈傷組織和非胚性愈組織傷兩種。B9 愈傷組織以黃色（圖1 A）為主，在首次繼代過程中愈傷組織全部褐化死亡，無繼代能力（圖1 B）。C4、A2 和A1 以黃色顆粒狀、干燥胚性愈傷組織為主，但在繼代3 次便出現(xiàn)嚴(yán)重褐化和水漬化，大量愈傷組織死亡進(jìn)而喪失繼代能力；C2、A4、A6 和A9 愈傷組織以淡黃色和紫色愈傷組織為主（圖1 C，D），前三者愈傷組織繼代能力強(qiáng)，胚性愈傷組織產(chǎn)生率高，后者愈傷組織在繼代過程中嚴(yán)重水漬化，產(chǎn)生大量非胚性愈傷組織，喪失繼代能力。不同基因型材料愈傷組織誘導(dǎo)率存在顯著差異（表2）。A4、A6 愈傷組織誘導(dǎo)率和胚性愈傷組織誘導(dǎo)率均在80%以上，與其余基因型比較存在顯著差異（P<0.05），B9、C4 和C2 愈傷組織誘導(dǎo)率居中（高于60%），A2 愈傷組織的誘導(dǎo)率最低（34.4 %），A9 和C2 的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率在60%以上、僅低于A4 和A6。

將愈傷組織接入分化培養(yǎng)基中，不同基因型愈傷組織出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)時(shí)間不同，A4 愈傷組織接入后最早出現(xiàn)分化現(xiàn)象，最早為第3 d（圖1 E）。A6、C2、A1、A2、C4 愈傷組織接入分化培養(yǎng)基后第7 d 開始出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，B9 和A9 接入分化培養(yǎng)基后第14 d才開始分化，30 d 芽點(diǎn)發(fā)育成叢生芽（圖1 F）。由表2 可知，不同基因型愈傷組織分化能力差異極顯著。A4 和A6 的胚性愈傷組織分化率最高，分別為91.8%和83.3%，分化過程中以芽先出現(xiàn)為主，極少分化為根，獲得叢生芽能力強(qiáng)，小苗健壯；其次為C2 和C4 分化率大于50%，大部分分化為芽、部分為根；B9 愈傷組織分化率最低為7%，與其他材料差異顯著（P<0.05）；材料分化率低的原因是在分化過程中部分愈傷組織更多分化為白色的根，只有少數(shù)分化成芽點(diǎn)后成苗。綜合比較誘導(dǎo)率和分化率，A4 和A6 材料的再生能力強(qiáng)；C2 胚性性愈傷組織誘導(dǎo)和分化能力較好，可以適當(dāng)改良培養(yǎng)條件以提高再生頻率；B9 的愈傷誘導(dǎo)率高但分化率極低，不適合用于離體培養(yǎng)。

2.2 南荻莖稈成分比較

圖1 南荻愈傷組織誘導(dǎo)及植株分化

表2 不同基因型愈傷組織誘導(dǎo)率和植株分化能力的比較（%）

由表3 可知，8個(gè)材料的莖稈成分中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、灰分和水分的含量均存在顯著差異。半纖維素含量均值A(chǔ)4 最大為40.87%，其次是A6（36.82%） 和B9（31.65%）， 最 小 的 為A1（27.23%）；纖維素和木質(zhì)素含量均值最小的均為A4，其次是A6，纖維素中均值最大的為A1，木質(zhì)素含量最低的是A4；在灰分含量方面所測(cè)材料的灰分量在2.03%～3.33%間，灰分最低的是A6，最高的為A4；而在105℃含水量和45℃總含水量?jī)烧呱螦6 含水量均是最低。

2.3 南荻愈傷組織誘導(dǎo)率和植株分化率與莖稈化學(xué)成分的回歸分析

表4 結(jié)果顯示，南荻愈傷組織誘導(dǎo)率與莖稈中半纖維素含量有正相關(guān)性，而與木質(zhì)素含量和105℃含水量呈顯著負(fù)相關(guān)，多元決定系數(shù)為0.977，說明半纖維素、木質(zhì)素以及105℃含水量是決定南荻幼穗誘導(dǎo)愈傷組織的主要因子。從胚性愈傷組織誘導(dǎo)率回歸模型可以看出，南荻胚性愈傷組織誘導(dǎo)率與莖稈的纖維素含量和45℃總含水量有顯著的負(fù)相關(guān)性，多元決定系數(shù)是0.811，表明這兩者在決定胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率上有重要作用。對(duì)胚性愈傷組織的植株分化率和相關(guān)因子進(jìn)行回歸分析顯示，它與半纖維素含量和45℃總含水量負(fù)相關(guān)，與木質(zhì)素含量和105℃含水量正相關(guān)，四者共同對(duì)分化率起主要影響作用。

表3 南荻莖稈化學(xué)成分含量比較 （%）

表4 誘導(dǎo)率和分化率與莖稈化學(xué)成分逐步回歸分析

3 討論與結(jié)論

基因型是影響植物表型的內(nèi)在因素，有研究表明基因型對(duì)多種植物的再生能力存在重要影響[17]。芒屬植物屬于較難再生的植物，基因型是影響芒再生頻率的首要內(nèi)在因素[18]。本研究表明不同基因型南荻再生頻率存在顯著差異，篩選再生頻率高的材料、尋找受基因型控制且影響南荻再生頻率的因素，對(duì)建立南荻高效繁殖體系具有重要作用。何立珍等[5]早在上世紀(jì)90年代就對(duì)南荻的不同外植體進(jìn)行比較研究，指出幼穗是南荻的最佳外植體，并且在適宜的培養(yǎng)基上獲得了較高的愈傷組織誘導(dǎo)率；易自力[6]對(duì)南荻愈傷組織誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基、激素配比及愈傷組織繼代能力進(jìn)行研究，獲得適宜的培養(yǎng)組合；郭夏宇等[7]也探究了激素和添加物對(duì)南荻再生頻率的影響；然而，研究者均未從基因型影響南荻再生頻率的角度進(jìn)行分析，且無相關(guān)研究報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，基因型對(duì)南荻愈傷組織誘導(dǎo)和分化均具有顯著影響，8種基因型的愈傷組織誘導(dǎo)率為34.4%～97.5%，胚性愈傷組織頻率為25.8%～92.9%；而植株分化率變動(dòng)范圍更廣，為7.0%～91.8%。在8種基因型材料中，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和植株分化率均以A4 和A6 為較高。

褐化是影響植株再生的一個(gè)重要原因，很多植物離體組織的再生能力差均是因?yàn)槠渫庵搀w褐化嚴(yán)重，不能獲得質(zhì)地優(yōu)異或不能成功誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生，尤其以木本植物最為明顯，木本植物木質(zhì)化嚴(yán)重在組織培養(yǎng)過程中分泌大量的酚類物質(zhì)氧化褐變，毒害外植體使植株再生能力下降，因此，木質(zhì)素含量與植株再生頻率有相關(guān)性。研究顯示芒屬植物木質(zhì)素含量和植株的再生頻率存在一定的相關(guān)性[11]。本研究對(duì)南荻莖稈的一些成分進(jìn)行測(cè)定，分析結(jié)果表明不同基因型材料的半纖維素、纖維素、木質(zhì)素、灰分和含水量均存在顯著差異，對(duì)它們與植株的愈傷組織誘導(dǎo)率、胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和胚性愈傷組織分化率進(jìn)行回歸分析顯示，愈傷組織誘導(dǎo)率主要受莖稈成份中的半纖維素、木質(zhì)素和105℃含水量的影響；胚性愈傷組織誘導(dǎo)率主要受纖維素和45℃總含水量含量影響，含水量和纖維素含量低胚性愈傷組織誘導(dǎo)高。將影響愈傷組織分化率的因素與愈傷組織誘導(dǎo)率的因素進(jìn)行比較，除以上3種影響因子外，45℃總含水量也對(duì)分化率有影響。綜合比較而言，纖維素含量高、木質(zhì)素和含水量含量低的材料再生頻率較高，該結(jié)論對(duì)于芒屬植物離體組織培養(yǎng)過程中的基因型選擇具有重要的指導(dǎo)意義。

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