多功能芽孢桿菌AF1的生長條件與生理耐受特性研究

楊艷紅，李世川，胡 燕，劉余江

(重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

芽孢桿菌多數(shù)為腐生菌，具有產(chǎn)生抗性芽孢、繁殖能力強(qiáng)、耐熱、耐酸堿、理化性質(zhì)穩(wěn)定、抑菌譜廣泛等優(yōu)點(diǎn)，存在很多潛在的特殊功能，特別是可產(chǎn)生多種胞外抗菌物質(zhì)和包括淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等在內(nèi)的多種酶類，因此在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及科學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用價(jià)值［1－3］。芽孢桿菌類微生物添加劑無毒、無害、無殘留，且具有促進(jìn)畜禽生長、防治疾病等功效，是國際公認(rèn)的可在飼料中直接使用的微生物菌種［4］。重慶理工大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室分離到一株能產(chǎn)生高淀粉酶和蛋白酶活性、且具有廣譜抗菌活性的芽孢桿菌。本文就其生理耐受性特性和發(fā)酵條件進(jìn)行研究，以期為該菌種應(yīng)用于飼料微生物添加劑提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種AF1，由重慶理工大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室分離。培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

1.2 生長培養(yǎng)基的篩選

1.2.1 碳氮源篩選

在PDA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，采用單因素實(shí)驗(yàn)分別篩選AF1生長的最佳碳源和氮源分別為:4%蔗糖，2%蛋白胨、0.5%尿素。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，對蔗糖、蛋白胨和尿素濃度進(jìn)行優(yōu)化，以測定OD600代表菌體濃度。各因素水平設(shè)定值見表1。

表1 碳氮源正交設(shè)計(jì)因素水平

1.2.2 無機(jī)鹽篩選

微生物生長所需的無機(jī)鹽一般有磷酸鹽、硫酸鹽、氯化物以及含有鈉、鉀、鈣、鎂、鐵等金屬元素的化合物。在細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)通常添加以下無機(jī)鹽:MgSO4.7H2O、K2HPO4、NaCl、MnSO4、H2O、CaCl2、NaH2PO4。本實(shí)驗(yàn)室選取以上6種無機(jī)鹽，在碳氮源篩選的基礎(chǔ)上，通過均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，以測定OD600代表菌體濃度。各因素設(shè)6個(gè)水平，其設(shè)定值見表2。

表2 無機(jī)鹽均勻設(shè)計(jì)因素水平

1.3 理化因素的篩選

先經(jīng)單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)分別設(shè)定:溫度為10，25，35 ℃;pH 值為 2.0，5.0，7.0;搖床轉(zhuǎn)速為 150，250，280 r/min。對這3個(gè)水平進(jìn)行初篩，結(jié)果顯示獲得較大OD600的條件分別是:pH值為7.0，溫度為35℃，轉(zhuǎn)速250 r/min。然后在確定的3個(gè)因素值附近分別設(shè)定3個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表3。

表3 理化因素正交設(shè)計(jì)因素水平

1.4 生理耐受性實(shí)驗(yàn)

1.4.1 pH 耐受性

以上述篩選的最優(yōu)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別調(diào)節(jié)不同的pH值，每個(gè)pH值做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，在篩選的最佳條件下培養(yǎng)20 h后測定OD600值。

1.4.2 豬膽鹽耐受性

以上述篩選的最優(yōu)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加豬膽鹽 0%，0.04%，0.08%，0.1%，0.2%，0.3%，每個(gè)濃度做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，在篩選的最佳條件下培養(yǎng)20 h后測定OD600值。

1.4.3 人工胃液耐受性

將AF1接種于以上篩選的最優(yōu)培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，并參照文獻(xiàn)［5－6］把AF1菌接種于人工胃液，在最佳條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，分別于0，30，60和120 min取樣，采用活菌平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)量。

1.4.4 人工腸液耐受性

將AF1接種于以上篩選的最優(yōu)培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，并參照文獻(xiàn)［5－6］把AF1菌接種于人工腸液，在最佳條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，分別于0，30，60和180 min取樣，采用活菌平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 生長培養(yǎng)基篩選

2.1.1 碳氮源篩選

由表4中極差值R可以得出各因素對AF1菌生長的影響由大到小依次為:尿素＞蛋白胨＞蔗糖。同時(shí)，也可以知道AF1菌液體培養(yǎng)的最佳碳源和氮源組合為A3B1C1，即蛋白胨2.5%，尿素0.5%，蔗糖3.0%。為了驗(yàn)證本次實(shí)驗(yàn)中所確定的培養(yǎng)條件(碳源和氮源)是否可靠，選用原正交實(shí)驗(yàn)中OD600值最大的實(shí)驗(yàn)號(A3B1C3)與所篩選出的最佳條件作對比驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表5所示?？梢娫瓕?shí)驗(yàn)中OD值最大的實(shí)驗(yàn)組合的OD值小于我們所篩選出最佳條件的OD值。因此，A3B1C1仍然是最佳的組合，同上述分析結(jié)果吻合。因此，最后確定AF1生長培養(yǎng)基中最佳碳源和氮源的組合為:3.0%蔗糖，0.5%尿素，2.5%蛋白胨。

表4 碳源和氮源正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 無機(jī)鹽篩選

對表6實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS軟件進(jìn)行回歸分析，可得出回歸方程為:y=6.62 －13.54x1+0.66x3。這是一個(gè)二元線性回歸方程，為檢驗(yàn)其可信性，對回歸方程進(jìn)行方差分析，其方差分析表［7］如表7所示。由方差分析結(jié)果可知該線性方程是比較可靠的，回歸方程中x1的系數(shù)為負(fù)，x3的系數(shù)為正，表明菌體OD600值隨因素x1(MgSO4·7H2O)的增加而下降，隨著因素x3(NaCl)的增加而上升。因此，在確定無機(jī)鹽的最優(yōu)方案時(shí)，將MgSO4·7H2O的量取下限，即為0%，NaCl的量取上限，即為1.0%。為了驗(yàn)證篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性，選取原實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中OD600值最大的實(shí)驗(yàn)條件(即表6中2號實(shí)驗(yàn))和篩選出的實(shí)驗(yàn)條件作對比驗(yàn)證。結(jié)果顯示，原設(shè)計(jì)中2號實(shí)驗(yàn)的OD600值為7.64，小于所篩選出最佳條件的OD600值9.96，可見實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。無機(jī)鹽是微生物生長必不可少的一類營養(yǎng)物質(zhì)，在細(xì)菌機(jī)體中的生理功能主要是作為酶活性中心的組成部分、維持生物大分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)并維持細(xì)胞的滲透壓平衡、控制細(xì)胞的氧化還原電位和作為某些微生物生長的能源物質(zhì)等。微生物生長所需的無機(jī)鹽一般有磷酸鹽、硫酸鹽、氯化物以及含有鈉、鉀、鈣、鎂、鐵等金屬元素的化合物。在微生物的生長過程中還需要一些微量元素。微量元素是指那些在微生物生長過程中起重要作用，而微生物機(jī)體對這些元素的需要量極其微小的元素，通常需要量在 10－6～10－8mol/L(培養(yǎng)基中含量)。微量元素一般參與酶的組成或使酶活化［8］。由上述結(jié)果可見，本實(shí)驗(yàn)中，K2HPO4、MnSO4.H2O、CaCl2、NaH2PO4對AF1菌的生長幾乎無影響，而MgSO4·7H2O對其生長有負(fù)影響，NaCl有正影響。最終只選定NaCl這一無機(jī)鹽補(bǔ)充到培養(yǎng)基中。這可能是由于本實(shí)驗(yàn)中的培養(yǎng)基中添加了天然土豆汁，其中含有豐富的微量元素可完全滿足AF1菌生長。綜合碳氮源篩選結(jié)果，AF1菌的生長培養(yǎng)基優(yōu)化為:馬鈴薯20 g，蔗糖 3 g，蛋白胨 2.5 g，尿素 0.5 g，NaCl 1.0 g，蒸餾水100 mL。本培養(yǎng)基中由于馬鈴薯的質(zhì)量不好控制，因此本實(shí)驗(yàn)室參照土豆的主要有效成分，以這些成分為篩選對象，對培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

表6 無機(jī)鹽均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果

表7 方差分析表

2.2 理化因素篩選

由極差值R可以得出各因素對AF1菌生長的影響由大到小依次為:溫度＞轉(zhuǎn)速＞初始pH值。同時(shí)，也可以知道AF1液體培養(yǎng)的最佳理化條件組合為A3B3C2，即溫度為37℃，初始pH值為7.0，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。

2.3 生理耐受性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 pH 耐受性

動(dòng)物胃中的pH值范圍常在2～7，一般為3.0。胃環(huán)境對細(xì)菌的破壞是pH依賴性的酸水解作用，當(dāng)pH值為2.5時(shí)，殺菌作用很明顯。因此，益生菌必須有良好的耐酸能力，才能通過高酸性的胃環(huán)境而到達(dá)腸道發(fā)揮作用［9］。由圖1可知，AF1在pH值為2～9時(shí)均可以生長，而在pH值為4～8時(shí)生長較好，其最佳生長pH值為7。因此，該菌有很好的耐酸性，可以耐受動(dòng)物胃的低pH環(huán)境，并順利進(jìn)入pH值約為7.6的小腸發(fā)揮作用。

表8 理化因素正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 AF1的pH耐受性

2.3.2 膽鹽耐受性

益生菌進(jìn)入腸道后，小腸中膽鹽的高滲透壓環(huán)境不利于其存活。動(dòng)物腸道中膽鹽的含量為0.03% ～0.3%(W/V)，并不斷發(fā)生變化，一般認(rèn)為其平均含量為0.03%［10］。如圖2所示，AF1菌株在膽鹽濃度為0.04% ～0.3%均有一定耐受能力。隨著膽鹽濃度的升高，AF1的存活數(shù)呈現(xiàn)緩慢的下降趨勢。因此，AF1菌株能耐受腸道的膽鹽環(huán)境。

2.3.3 人工胃液耐受性

動(dòng)物的胃在pH值為3.0左右的酸性環(huán)境下激活胃液中的胃蛋白酶原，從而殺死胃內(nèi)的細(xì)菌，食物通過胃的時(shí)間相對較短，一般為1～2 h［11］。由表9可知，AF1在加了胃蛋白酶的人工胃液中2 h后還能存活，因此，AF1對胃液有耐受能力。

表9 在不同培養(yǎng)時(shí)間下AF1在模擬胃液中的存活率

2.3.4 人工腸液耐受性

小腸內(nèi)消化是整個(gè)消化過程中重要的階段，也是各種益生菌制劑發(fā)揮作用的場所。小腸液的pH值約為7.6，其中除了大量的水分外，還有各種酶、膽汁鹽等多種成分，對腸內(nèi)菌群有著多方面的影響。食物通過動(dòng)物小腸的平均時(shí)間約為1.5 h。益生菌只有經(jīng)受住小腸液作用，保持一定數(shù)量的存活率才能發(fā)揮作用［5，11］。由表10可知，人工腸液對AF1菌株幾乎沒有影響，這說明AF1菌株能夠耐受腸液環(huán)境，可以在腸液中生長。

表10 在不同培養(yǎng)時(shí)間下AF1在模擬人工腸液中的存活率

3 結(jié)束語

本文研究的芽孢桿菌AF1不僅可以產(chǎn)生高活性淀粉酶和蛋白酶，還具有廣譜抗菌活性，若用于動(dòng)物，不僅可以提高飼料利用率，促進(jìn)生長，同時(shí)可以預(yù)防動(dòng)物疾病發(fā)生。通過對AF1研究，發(fā)現(xiàn)其具有腸道環(huán)境耐受性好的優(yōu)點(diǎn)，可為新型飼料微生態(tài)制劑的開發(fā)提供菌種來源。

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