CX26第86位氨基酸多態(tài)性與遺傳性聾相關(guān)性分析

時(shí)晰　董燕粉　邱士偉　莊偉　喬月華徐州醫(yī)學(xué)院聽(tīng)力中心，徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院聽(tīng)力中心

·基礎(chǔ)研究·

CX26第86位氨基酸多態(tài)性與遺傳性聾相關(guān)性分析

時(shí)晰1董燕粉1邱士偉1莊偉1喬月華2
1徐州醫(yī)學(xué)院聽(tīng)力中心，
2徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院聽(tīng)力中心

目的 本研究在細(xì)胞生物學(xué)水平，對(duì)第86位氨基酸分別為Thr，Ser，Arg的CX26蛋白的膜定位生物學(xué)功能進(jìn)行鑒定，進(jìn)而結(jié)合臨床數(shù)據(jù)分析該位點(diǎn)不同多態(tài)性突變的潛在致聾可能性。方法本研究借助GFP融合型慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，分別將第86位氨基酸為Thr，Ser，Arg的CX26-GFP融合蛋白在小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，并在熒光顯微鏡下觀察融合蛋白的細(xì)胞膜定位現(xiàn)象。結(jié)果第86位氨基酸發(fā)生Ser突變后，CX26蛋白仍能夠正常定位于細(xì)胞膜表面，并形成間隙鏈接結(jié)構(gòu)，這一表型與（第86位氨基酸為Thr的）野生型CX26蛋白并無(wú)明顯差異；只有當(dāng)?shù)?6位氨基酸突變?yōu)锳rg時(shí)，導(dǎo)致CX26蛋白功能喪失。結(jié)論這些現(xiàn)象表明CX26 T86R可能為潛在致聾突變，而CX26 T86S為不影響蛋白功能的氨基酸多態(tài)性突變。該結(jié)論與臨床篩查經(jīng)驗(yàn)性結(jié)果一致。

遺傳性耳聾；CX26蛋白；螺旋神經(jīng)節(jié)

先天性耳聾是人類常見(jiàn)出生缺陷疾病，發(fā)病率約為1/700-1000［1］，其中一半以上為遺傳性聽(tīng)功能障礙［2］。另有研究提出，近36.9%的兒童感音神經(jīng)性聾與GJB2基因突變有關(guān)，該基因所編碼的CX26蛋白參與內(nèi)耳K+轉(zhuǎn)運(yùn)，是維持內(nèi)耳離子穩(wěn)態(tài)平衡的關(guān)鍵性間隙鏈接蛋白［3］。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，到目前為止已發(fā)現(xiàn)的包括遺傳多態(tài)性及未分類鑒定的GJB2基因突變位點(diǎn)多達(dá)150個(gè)以上（http：//davinci.crg.es/deafness）［4-10］。依據(jù)跨種族流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，按致聾突變發(fā)生頻率將GJB2基因突變又分為常見(jiàn)突變和罕見(jiàn)突變［11-16］，由于針對(duì)同一個(gè)罕見(jiàn)位點(diǎn)的重復(fù)報(bào)道相對(duì)較少，因此這類突變的致病相關(guān)性往往無(wú)法進(jìn)行大樣本統(tǒng)計(jì)學(xué)研究，這也為如何對(duì)其中一些存在氨基酸多態(tài)性的非致病突變的甄別及鑒定工作提出了挑戰(zhàn)［17］。

CX26蛋白的第86位氨基酸同樣存在此類多態(tài)性現(xiàn)象，多數(shù)報(bào)道認(rèn)為野生型CX26蛋白的第86位氨基酸為蘇氨酸（Thr），其主要對(duì)應(yīng)的一類致病突變是CX26 T86R（GJB2 c.257C＞G）（第86位蘇氨酸（Thr）突變?yōu)榫彼幔ˋrg））［4，7］；在耳聾基因篩查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)CX26蛋白第86位氨基酸存在另一種突變形式CX26 T86S（GJB2c.257-258CG＞GC）（第86位蘇氨酸（Thr）突變?yōu)榻z氨酸（Ser）），但目前沒(méi)有臨床證據(jù)表明這類突變與耳聾發(fā)生有關(guān)，CX26 T86S（GJB2c.257-258CG＞GC）被認(rèn)為是非致病性的氨基酸多態(tài)性［16，18］。因此在EBI數(shù)據(jù)庫(kù)中也存在來(lái)自不同研究工作所提交的兩種GJB2基因CDS序列（EBI IDAAP35378；ID AAD21314）（圖1所示）［19］。但目前為止，針對(duì)存在于CX26蛋白第86位的3種氨基酸（Thr，Ser，Arg；對(duì)應(yīng)密碼子分別為ACG，AGC，AGG）對(duì)該蛋白生物學(xué)功能影響的系統(tǒng)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究借助GFP融合型慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，以既有報(bào)道中CX26蛋白第86位氨基酸多態(tài)性（Thr，Ser，Arg）為依據(jù)，成功在小鼠原代SGN（spiral ganglion neuron，SGN）細(xì)胞中，對(duì)第86位分別為Thr，Ser，Arg的不同CX26蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行初步比較分析，在一定程度上解釋了這些氨基酸多態(tài)性與遺傳性耳聾發(fā)病相關(guān)性的潛在機(jī)理。

1　材料與方法

1.1序列相似性分析

借助北京大學(xué)在線生物信息學(xué)分析平臺(tái)（www. abc.pku.cn），對(duì)來(lái)自EBI數(shù)據(jù)庫(kù)中由不同研究工作所提交的兩種正常GJB2基因CDS序列（EBI ID AAP35378；ID AAD21314）進(jìn)行序列相似度分析。

1.2質(zhì)粒構(gòu)建及病毒包裝

本研究中所使用的GJB2野生型基因（編碼蛋白CX26 p.86 Thr）克隆自正常人血液基因組DNA，GJB2基因克隆引物序列分別為：F：GggatccATGGATTG GGGCACGCT；R：CGacgcgtTAAACTGGCTTTTTTGACTT（以上引物序列包含酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基），經(jīng)BamHI和MluI位點(diǎn)克隆進(jìn)入GFP融合型慢病毒表達(dá)載體pWPXLD，并以該質(zhì)粒為基礎(chǔ)，由南京卓?jī)|生物科技有限公司成功構(gòu)建了其他點(diǎn)突變慢病毒表達(dá)質(zhì)粒（編碼蛋白分別為CX26 p.86 Ser，CX26 p.86 Arg）。隨后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)慢病毒包裝流程，首先將1×106293T細(xì)胞接種于6cm平皿中，次日待細(xì)胞融合度接近70%時(shí)，將pWPXLD，pPAX，pMD2G分別以4μg，3μg，1μg與24μl ShiningJet轉(zhuǎn)染試劑（北京冉升）混合于無(wú)血清培養(yǎng)基中，靜置20mim后逐滴加入待轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，6h后更換為含10% FBS的正常DMEM培養(yǎng)基，分別于轉(zhuǎn)染后48h，72h，96h后收集培養(yǎng)基上清靜置于4℃冰箱待用，混合3次所收集的病毒原液于50ml離心管中，2500rpm，4℃離心5min后（Eppendorf 5702臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司，美國(guó)），用20ml注射器收集上清，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，將所得濾液直接注入100kD Milipore超濾柱套管內(nèi)，經(jīng)3500g，4℃離心40min后濃縮至200μl，每50μl分裝于一只1.5ml EP管中，即為待用的慢病毒濃縮液。

1.3小鼠原代SGN細(xì)胞分離及病毒感染

選用出生1-6天發(fā)育正常的Babl/c乳鼠10只（耳蝸20個(gè)），在解剖顯微鏡（ZSM-45 XTL-2400，上海思長(zhǎng)約光學(xué)儀器有限公司，中國(guó)）下沿小鼠頭部矢狀面中部剖開(kāi)，去除腦組織后，在枕骨大孔上方取出耳蝸置于pH7.4的Hank's液中，高倍鏡下剝離骨質(zhì)蝸殼，去除膜性耳蝸中外側(cè)血管紋及Corti's器，僅剩內(nèi)側(cè)螺旋神經(jīng)節(jié)組織部分，小心分離神經(jīng)組織，盡量避免損傷神經(jīng)元細(xì)胞。隨即將所分得的SGN組織塊放入1.5ml EP管內(nèi)，D-Hank's平衡液清洗一遍后加入1ml 2%的胰酶，37度溫箱內(nèi)孵育數(shù)分鐘后加入0.5ml含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基終止胰酶作用，并進(jìn)行數(shù)次機(jī)械吹打。隨后經(jīng)300g離心5mim后棄除上清，用少量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至3.5cm培養(yǎng)皿內(nèi)經(jīng)多聚賴氨酸處理后的蓋玻片上，小心放入37度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，次日待細(xì)胞貼壁后加入1ml新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)用另外1ml培養(yǎng)基稀釋一只濃縮病毒，與4μl 5mg/ ml的polybrene混合后逐滴加入相同培養(yǎng)皿內(nèi)，完成對(duì)SGN細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)操作，24h后更換為正常無(wú)病毒培養(yǎng)基，48h后可用熒光顯微鏡（Olympus FV1000，奧林帕斯公司，日本）觀察所表達(dá)的不同CX26-GFP蛋白在細(xì)胞中的定位情況。

2　結(jié)果

2.1CX26蛋白第86位氨基酸非致病多態(tài)性比較

借助北京大學(xué)在線生物信息學(xué)分析平臺(tái)（www. abc.pku.cn），對(duì)來(lái)自EBI數(shù)據(jù)庫(kù)中由不同研究工作所提交的兩種正常GJB2基因CDS序列（EBI ID AAP35378；IDAAD21314）進(jìn)行序列相似度分析發(fā)現(xiàn)，兩條序列第257-258位堿基存在差異，分別為CG 或GC，所組成的密碼子分別為ACG或AGC （256-258），對(duì)應(yīng)的氨基酸分別為蘇氨酸（Thr）或絲氨酸（Ser），從而構(gòu)成了CX26蛋白第86位氨基酸的兩種非致病多態(tài)性形式（圖1所示）。

圖1　GJB2基因及其對(duì)應(yīng)CX26蛋白序列多態(tài)性分析

（上方）GJB2基因第257-258位堿基多態(tài)性差異比較，（下方）CX26蛋白第86位氨基酸多態(tài)性比較。

2.2CX26蛋白生物學(xué)功能分析

依據(jù)正常CX26蛋白第86位氨基酸存在蘇氨酸（Thr）或絲氨酸（Ser）兩種非致病形式，并結(jié)合Arg為該位點(diǎn)致病突變的報(bào)道［4，7］，本研究成功構(gòu)建了一系列CX26-GFP融合蛋白慢病毒表達(dá)載體，包裝病毒后轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠原代SGN細(xì)胞，48h后利用熒光顯微鏡對(duì)第86位分別為蘇氨酸（Thr），絲氨酸（Ser），精氨酸（Arg）的不同CX26蛋白的膜定位功能進(jìn)行初步比較分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示：

圖2　第86位分別為Thr，Ser，Arg的不同CX26-GFP蛋白的膜定位功能分析 下排圖片分別為上排圖片中白色方框區(qū)域內(nèi)的放大圖像，箭頭所標(biāo)記部分即為定位于細(xì)胞膜上的CX26-GFP p86 Thr（左圖）和CX26-GFP p86 Ser（中圖）間隙連接蛋白所形成的通道結(jié)構(gòu)，右圖所示為無(wú)法定位于細(xì)胞膜并形成通道結(jié)構(gòu)的CX26-GFP p86 Arg蛋白。

圖2中左側(cè)縱列圖片顯示第86位氨基酸為蘇氨酸（Thr）的CX26-GFP蛋白在小鼠原代SGN細(xì)胞中呈明顯的亮點(diǎn)狀態(tài)分布（白色箭頭所示），表明該蛋白能夠有效地定位于細(xì)胞膜上，并形成通道蛋白的相關(guān)結(jié)構(gòu)；當(dāng)該位點(diǎn)突變?yōu)榻z氨酸（Ser）時(shí)（中間縱列圖片），不會(huì)明顯改變這種膜定位現(xiàn)象。然而當(dāng)?shù)?6位氨基酸突變?yōu)榫彼幔ˋrg）時(shí)（右側(cè)縱列圖片），直接導(dǎo)致突變蛋白無(wú)法定位于細(xì)胞膜上，在胞質(zhì)中呈彌散狀均勻分布，據(jù)此推測(cè)，該突變極可能導(dǎo)致聾病發(fā)生。

3　討論

本研究借助慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，分別將包含第86氨基酸多態(tài)性的3種GX26-GFP融合蛋白在小鼠原代SGN細(xì)胞中成功表達(dá)；隨后利用熒光顯微鏡觀察不同CX26蛋白在細(xì)胞中的定位情況，結(jié)果表明第86位分別為Thr或Ser的CX26蛋白能夠正常定位到細(xì)胞膜上，并形成類似于間隙鏈接的通道蛋白結(jié)構(gòu)，當(dāng)然相關(guān)突變是否導(dǎo)致電生理效應(yīng)改變?nèi)杂写M(jìn)一步確認(rèn)。然而當(dāng)?shù)?6位氨基酸突變?yōu)锳rg時(shí)，該蛋白無(wú)法實(shí)現(xiàn)胞膜定位，呈胞質(zhì)彌散分布狀態(tài)。其中關(guān)于第86位Thr突變?yōu)锳rg的現(xiàn)象，與之前在人293T細(xì)胞中的部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似［4，7］，本研究將這一現(xiàn)象首次在小鼠內(nèi)耳聽(tīng)神經(jīng)細(xì)胞中得以驗(yàn)證，另外同時(shí)填補(bǔ)了關(guān)于第86位為Ser的CX26蛋白暫無(wú)細(xì)胞生物學(xué)功能驗(yàn)證依據(jù)的空白，盡管相關(guān)的電生理功能仍有待今后研究加以確認(rèn)，但本研究所得的實(shí)驗(yàn)證據(jù)能夠在一定程度上做為臨床篩查中該位點(diǎn)為非致病突變的理論依據(jù)。

此外通過(guò)氨基酸結(jié)構(gòu)比較分析不難發(fā)現(xiàn)：Thr和Ser同屬于極性較弱的疏水性氨基酸，且兩者結(jié)構(gòu)非常相似，側(cè)鏈長(zhǎng)度基本一致，功能基團(tuán)僅僅相差一個(gè)甲基。據(jù)此推測(cè)，當(dāng)?shù)?6位Thr改變?yōu)镾er后，對(duì)CX26蛋白結(jié)構(gòu)的影響基本可以忽略。因此，第86位Ser為非致病突變的說(shuō)法（CX26 T86S），從氨基酸的結(jié)構(gòu)生物化學(xué)角度也可以得到合理解釋；相反，當(dāng)CX26蛋白第86位氨基酸由Thr突變?yōu)锳rg時(shí)，情況則完全不同，因?yàn)锳rg的極性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Thr，此外Arg側(cè)鏈長(zhǎng)度過(guò)大，因此極可能導(dǎo)致CX26蛋白構(gòu)象改變，使之無(wú)法與細(xì)胞膜表面或兩個(gè)單體之間形成有效的疏水作用界面，影響結(jié)合效果，導(dǎo)致功能喪失，這也在一定程度上解釋了CX26 T86A為致聾突變的潛在發(fā)病機(jī)制。

盡管CX26蛋白第86位氨基酸變異仍屬于罕見(jiàn)位點(diǎn)突變范疇，但關(guān)于該位點(diǎn)的多態(tài)性報(bào)道已在國(guó)內(nèi)外眾多耳聾基因篩查研究中被廣泛涉及［4，7，16，17，20］。目前結(jié)合這些研究結(jié)果所對(duì)應(yīng)的臨床表型可以初步確定，CX26蛋白第86位氨基酸在自然界中存在3種多態(tài)性，即Thr，Ser以及Arg；這些氨基酸多態(tài)性所對(duì)應(yīng)的密碼子分別為 ACG，AGC，AGG（GJB2 256-258bp）。我們的研究結(jié)果證明，當(dāng)?shù)?6位氨基酸突變?yōu)锳rg時(shí)導(dǎo)致CX26蛋白的細(xì)胞生物學(xué)功能異常。這一結(jié)論與眾多關(guān)于GJB2 c.257 C＞G p.T 86 R為致聾突變的結(jié)論一致。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)?6位Thr改變?yōu)镾er時(shí)，CX26蛋白功能變化不大（圖2），這一結(jié)果同樣得到了臨床篩查數(shù)據(jù)的支持，在國(guó)內(nèi)部分研究中提到，GJB2 c.257-258 GC＞CG p.S 86 T突變是導(dǎo)致氨基酸多態(tài)性的非致聾突變，但值得注意的是，這些研究認(rèn)為該多態(tài)性突變是CX26蛋白的第86位氨基酸由Ser突變?yōu)門hr所致［17，20］。盡管這兩種氨基酸均不會(huì)影響CX26蛋白的生物學(xué)功能，但這種提法（GJB2 c.257-258 GC＞CG p.S 86 T）與之前關(guān)于致病突變（GJB2 c.257 C＞G p.T 86 R）［4，7，16］表述存在矛盾，后者默認(rèn)為CX26蛋白的第86位氨基酸為Thr，而前者則默認(rèn)為CX26蛋白的第86位氨基酸為Ser，這直接導(dǎo)致關(guān)于CX26蛋白第86位氨基酸多態(tài)性報(bào)道之間的混淆表述以及統(tǒng)計(jì)學(xué)偏差。因此筆者建議，野生型CX26蛋白第86位氨基酸應(yīng)統(tǒng)一認(rèn)定為蘇氨酸（Thr）（普遍性原則），使用（GJB2 c.257-258 CG＞GC p.T 86 S）描述非致病絲氨酸（Ser）突變，以便與致聾突變（GJB2 c.257 C＞G p.T 86 R）相關(guān)報(bào)道中的表述保持一致，確保在后續(xù)關(guān)于CX26蛋白第86位氨基酸多態(tài)性篩查報(bào)道中，能夠采用統(tǒng)一的野生型序列作為數(shù)據(jù)分析依據(jù)。

另外值得關(guān)注的是，本研究提供了一種全新的技術(shù)手段，能夠針對(duì)缺乏致病相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的GJB2基因罕見(jiàn)突變位點(diǎn)進(jìn)行簡(jiǎn)單有效的生物學(xué)功能鑒定，為這些罕見(jiàn)位點(diǎn)的潛在致病性研究提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)而為臨床篩查中發(fā)現(xiàn)的相關(guān)位點(diǎn)突變攜帶者，給以更加準(zhǔn)確的理論指導(dǎo)。

4　結(jié)論

總而言之，本研究首次將已報(bào)道的CX26蛋白第86位氨基酸存在的3種多態(tài)性進(jìn)行集中分析，并通過(guò)分子生物學(xué)手段對(duì)在細(xì)胞中的功能進(jìn)行驗(yàn)證。最終證實(shí)只有當(dāng)?shù)?6位氨基酸突變?yōu)锳rg時(shí)，CX26蛋白功能喪失。該結(jié)論與臨床篩查所得經(jīng)驗(yàn)性結(jié)果一致。另外本研究建立了一種能夠有效鑒定突變型CX26蛋白膜定位功能的技術(shù)手段，這將有助于為相關(guān)突變攜帶者提供更加準(zhǔn)確的發(fā)病可能性診斷意見(jiàn)。

5　致謝

本研究主要獲得以下資金支持：國(guó)家自然科學(xué)基金 81470684，江蘇省臨床醫(yī)學(xué)科技專項(xiàng)b12014032，江蘇省六大人才高峰2014-WSN-043，中國(guó)博士后基金2015M571818，江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃201510313003Z。

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Polymorphism of the 86th amino acid in CX26 protein and hereditary deafness

SHI Xi1，DONG Yanfen1，QIU Shiwei1，ZHUANG Wei1，QIAO Yuehua 2
1 The Institute of Audiology and Speech Science，Xuzhou Medical Collage，Xuzhou 221004，China
2 The Institute of Audiology and Speech Science，the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical Collage，Xuzhou 221006，China Corresponding author：QIAO YuehuaEmail：oto8558@163.com

Objective To investigate the member localization function of CX26 protein when its 86th amino acid is Thr,Ser or Arg,and its relations to deafness.Methods CX26-GFP protein with either Thr,Ser or Arg as the 86th amino acid was expressed in mouse SGN cells via the GFP fusion type lenti-virus expression system.The membrane localization of the fusion protein was observed under a fluorescence microscope. Results The mutated protein of CX26 T86S was localized to cell membrane and form gap conjunction structures,showing no difference to the wild type CX26 protein(with Thr as the 86th amino acid).However,the gap conjunction structure disappeared when the mutation was CX26 T86A.Conclusion These results indicate that the CX26 T86R mutation may be a cause of hearing loss,but the CX26 T86S as a non-pathogenic polymorphism mutation does not affect functions of the CX26 protein.The results are in accordance with the results of clinical screening.

Heredity deafness；CX26；SGN

R764.43

A

1672-2922（2015）04-733-4

2015-11-3審核人：郭維維）

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.04.041

國(guó)家自然科學(xué)基金81470684，江蘇省臨床醫(yī)學(xué)科技專項(xiàng)b12014032，江蘇省六大人才高峰2014-WSN-043，中國(guó)博士后基金 2015M571818，江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃201510313003Z。

時(shí)晰，博士，助理研究員，研究方向：老年性耳聾

喬月華，Email：oto8558@163.com