不同方法構(gòu)建豚鼠膜迷路積水模型的對比研究

蔣子棟　高帆　孫程成北京協(xié)和醫(yī)院耳鼻咽喉科00730首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院耳鼻咽喉科0000

·基礎(chǔ)研究·

不同方法構(gòu)建豚鼠膜迷路積水模型的對比研究

蔣子棟1高帆2孫程成1
北京協(xié)和醫(yī)院耳鼻咽喉科100730
首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院耳鼻咽喉科100020

目的采用不同的方法建立豚鼠膜迷路積水的動物模型并對相關(guān)參數(shù)進(jìn)行對比分析，確定目標(biāo)建模的有效方法。方法80只豚鼠分成四組，每組20只，包括手術(shù)單耳建模，手術(shù)雙耳建模，注射醛固酮組，注射血管加壓素組。1月后，取存活的豚鼠的顳骨，分別進(jìn)行火棉膠和冰凍切片，光學(xué)顯微鏡觀察建模狀況。通過統(tǒng)計學(xué)方法，對不同組間動物的成活率、建模的成功率、耳蝸積水特點、以及制片因素對成像效果影響進(jìn)行對比分析。結(jié)果手術(shù)的方法可以分別建立單耳模型和雙耳模型，成功率100%（22/ 22），死亡率分別為15%（3/20），75%（15/20）組間有顯著性差異P＜0.05。藥物的方法建立雙耳模型，醛固酮組死亡率為5%（1/20），成功率89.4%（17/19）；血管加壓素組死亡率為5%（1/20），成功率73.7%（14/19），成功率在藥物組間有顯著性差異P＜0.05。手術(shù)組總死亡率為45%（18/40），藥物組總死亡率為5%（2/ 40），有顯著性差異P＜0.01。手術(shù)組耳蝸積水程度重度90.9%（20/22），中度18.1%（4/22）；藥物組耳蝸積水程度重度21%（8/38），中度47.3%（18/38），輕度31.5%（12/38）。火棉膠和冰凍切片的選擇不影響組織切片結(jié)果。結(jié)論根據(jù)實驗?zāi)繕?biāo)進(jìn)行選擇建模方法，可以節(jié)約動物成本，提高建模效率。

膜迷路積水；豚鼠；模型

梅尼埃病是常見的內(nèi)耳病，引發(fā)患者發(fā)作性眩暈、波動性感音神經(jīng)性耳聾、耳鳴和耳悶脹感的癥狀；它是一種可以致殘的疾病，一直是臨床研究的熱點，2015年頒布了新版梅尼埃病診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］，將引發(fā)廣泛的關(guān)注和研究。梅尼埃病沒有特異性生物學(xué)標(biāo)志，臨床診斷依據(jù)癥狀診斷和排除診斷；它病因不明，唯一明確的是其病理改變是內(nèi)耳膜迷路積水［2］，臨床診治針對內(nèi)耳膜迷路積水。因為活體無法進(jìn)行病理組織學(xué)研究，梅尼埃病的基礎(chǔ)研究主要依據(jù)動物模型。

1965年，kimura［3］首先報道通過手術(shù)破壞內(nèi)淋巴囊和內(nèi)淋巴管的方法，建立內(nèi)耳膜迷路積水動物模型，此后，用其它方法成功建模的研究陸續(xù)報告［4，5，6］，但缺少不同建模方法間系統(tǒng)的對照研究，尤其是動物死亡率和建模成功率。我們在同一組群中，通過不同的方法建模，包括手術(shù)和藥物；通過對建模成功率、耳蝸積水程度特點、動物死亡率、切片過程中相關(guān)因素對建模的影響的統(tǒng)計學(xué)分析以及不同方法建立模型的可能機(jī)制進(jìn)行討論，尋找節(jié)約動物成本，提高建模效率的正確途徑，為準(zhǔn)備開展梅尼埃病實驗學(xué)研究人員提供可靠的經(jīng)驗。

1　材料和方法

1.1動物

選健康雜色豚鼠，（普通級，北京芳元緣養(yǎng)殖場，動物許可證：SCXK（京）2009-0014），雌雄不限，體重250-300g，鼓膜正常，耳廓反射靈敏，無眼震及平衡障礙。80只豚鼠隨機(jī)分成四組，每組20只，包括手術(shù)單耳建模，手術(shù)雙耳建模，注射醛固酮組，注射血管加壓素組。飼養(yǎng)1月后，取存活的豚鼠的顳骨，分別進(jìn)行火棉膠和冰凍切片，光學(xué)顯微鏡觀察建模狀況。

1.2藥物建模

醛固酮組：連續(xù)7天腹腔注射醛固酮（SIGMA，706035），劑量100μg/0.1kg，每日一次［7］。加壓素組：連續(xù)7天腹腔注射精氨酸加壓素（SIGMA，V1880），劑量50μg/kg，每日一次［8］。

1.3手術(shù)建模

豚鼠麻醉后，麻醉藥選用氯胺酮（50mg/kg）、塞拉嗪（3.8g/kg），在手術(shù)顯微鏡下磨去枕骨，暴露硬腦膜及乙狀竇后緣，雙極電凝處理乙狀竇，在硬腦膜外暴露前庭導(dǎo)水管顱內(nèi)開口處，將內(nèi)淋巴囊破壞，用0.5mm細(xì)鉆沿前庭導(dǎo)水管方向鉆入，埋入骨蠟，縫合傷口。通過同樣方法處理對側(cè)，手術(shù)建立雙耳模型。術(shù)后動物蘇醒前放入保溫墊上保暖，觀察呼吸，定期吸痰。

1.4耳蝸積水程度分度

正常情況下，耳蝸內(nèi)前庭膜（Reissner's Membrane）以30度直線延伸，將基底膜以上的空間分為前庭階和蝸管兩部分，蝸管面積約為前庭階的1/2（圖1）。當(dāng)膜迷路積水時，前庭膜向前庭階方向膨隆，蝸管面積增大。將耳蝸積水粗略分三度，輕度：蝸管的面積占基底膜上總面積的1/3-1/2（圖2）；中度：蝸管的面積占基底膜上總面積的1/2-2/3（圖3）；重度：蝸管的面積占基底膜上總面積的2/3以上（圖4）。

圖1　

圖2　

圖3　

圖4　

1.5數(shù)據(jù)分析

所用數(shù)據(jù)用SAS軟件進(jìn)行卡方檢驗，P＜0.05為差異有顯著性。

2　結(jié)果

2.1病理形態(tài)學(xué)變化

正常豚鼠，前庭膜為單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從基底膜的中部1/3延伸到耳蝸骨壁內(nèi)側(cè)。膜迷路積水時，部分前庭膜為復(fù)層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，耳蝸各回前庭膜不同層度向前庭階方向膨隆，有些與骨壁相連，有些出現(xiàn)前庭膜破裂。

2.2手術(shù)的方法可以分別建立單耳模型和雙耳模型，藥物的方法建立雙耳模型，詳情見（表1）。比較雙耳手術(shù)和單耳手術(shù)的死亡率，分別為75%（15/20）和15%（3/20），組間有顯著性差異P＜0.05。藥物組的死亡率皆為5%（1/20）。手術(shù)組總死亡率為45%（18/ 40），藥物組總死亡率為5%（2/40），有顯著性差異P＜0.01。成活動物中，手術(shù)組豚鼠建模成功率為100% （22/22），注射醛固酮組成功率89.4%（17/19），注射血管加壓素組成功率73.7%（14/19），成功率在藥物組間有顯著性差異P＜0.05詳情見（表2）。手術(shù)組耳蝸積水程度重度90.9%（20/22），中度18.1%（4/22）；藥物組耳蝸積水程度重度21%（8/38），中度47.3% （18/38），輕度31.5%（12/38）。火棉膠和冰凍切片的選擇不影響組織切片結(jié)果。

3　討論

梅尼埃病（Meniere disease，MD）是常見的內(nèi)耳病，表現(xiàn)為發(fā)作性眩暈、波動性感音神經(jīng)性耳聾、耳鳴和耳脹滿感。內(nèi)淋巴積水（endolymphatic hydrops，EH），又稱膜迷路積水，1938年，由Hallpike和Cairns發(fā)現(xiàn)其為梅尼埃病的基本病理變化。自1861年，Meniere首先描述癥狀以來，近1個半世紀(jì)的不懈努力和大量研究，目前能夠確定的仍然局限于其病理變化為內(nèi)耳膜迷路積水，臨床診斷依然是癥狀診斷和排除診斷，實驗室診斷和臨床治療針對發(fā)現(xiàn)和控制內(nèi)耳膜迷路積水。由于活體無法進(jìn)行內(nèi)耳組織形態(tài)學(xué)研究，膜迷路積水動物模型是研究梅尼埃病發(fā)病機(jī)制、病理特征、生理改變和治療方法的重要手段。

Salt和Plontke［9］對內(nèi)耳膜迷路積水動物模型建模方式和特點進(jìn)行系統(tǒng)分類，包括急性建模和慢性建模，其中急性建模的方法包括：1）人工內(nèi)淋巴液注入內(nèi)淋巴系統(tǒng)引起壓力改變；2）腦脊液壓力控制的改變；3）115DB低頻聲刺激誘發(fā)；4）透明質(zhì)酸凝膠注入耳蝸頂轉(zhuǎn)后誘發(fā)；5）毒素進(jìn)入內(nèi)淋巴引發(fā)cAMP控制的改變。慢性建模的方法包括：1）手術(shù)建模；2）醛固酮建模；3）血管加壓素建模；4）醛固酮和脂多糖建模。國內(nèi)也有類似綜述對建模方法進(jìn)行分析。到目前為止，已經(jīng)發(fā)表的相關(guān)研究文章，主要針對單個建模方法的探討，缺少建模方法之間優(yōu)缺點的橫向?qū)Ρ取Ｈ欢?，對于即將開展內(nèi)耳膜迷路積水實驗研究的人員而言，亟需了解每種方法的建模細(xì)節(jié)，通過選擇合理方法，提高實驗效率。本研究中，我們采用自身研究團(tuán)隊有成功建模經(jīng)驗的、可以推薦未來廣泛使用的慢性建模的方法進(jìn)行對照研究，在同一組群中，通過不同的方法建模，包括手術(shù)和藥物；通過對建模成功率、耳蝸積水程度特點、動物死亡率及切片過程中相關(guān)因素對建模的影響的統(tǒng)計學(xué)分析和討論，尋找節(jié)約動物成本，提高建模效率的最佳途徑。

表1　組間死亡率對比

表2　組間成功率對比

抗利尿激素（antidiuretic hormone）是下丘腦（視上核和室旁核）合成和分泌的，又稱為血管加壓素（vasopressin），以神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒的形式經(jīng)軸突運送到垂體后葉而得以釋放。1999年，Kitano發(fā)現(xiàn)膜迷路積水與血管加壓素有關(guān)［10］。2000年，Takeda等人［4］通過豚鼠腹腔注射精氨酸加壓素，建立雙耳膜迷路積水。注射血管加壓素誘發(fā)膜迷路積水的機(jī)制不明，顧鳳鳴等通過針對大鼠模型的基因芯片研究，推測和內(nèi)淋巴囊水通道蛋白表達(dá)改變有關(guān)，建模成功率70%左右［8］。Kitahara等人［11］發(fā)現(xiàn)，梅尼埃病患者的眩暈發(fā)作與血漿中精氨酸加壓素有關(guān)，Katagir等人［12］最新發(fā)現(xiàn)，延長精氨酸加壓素注射時間，動物膜迷路積水的程度增加，成功率達(dá)100%。本研究中，注射血管加壓素組建模成功率73.7%（14/19），死亡率為5%（1/20），死亡原因不明。醛固酮（aldosterone）又稱為鹽皮質(zhì)激素，是由腎上腺外部（球狀帶）分泌的激素。1997年，Dunnebier等人［6］在用Kimura的方法建立單耳模型1個月后，給予豚鼠注射醛固酮，結(jié)果手術(shù)耳（手術(shù)加醛固酮作用側(cè)）出現(xiàn)中、重度膜迷路積水，而對側(cè)耳（單純?nèi)┕掏饔脗?cè)）出現(xiàn)輕度膜迷路積水。我們在Dunnebier等人研究的基礎(chǔ)上，單純注射醛固酮建立動物模型，延長觀察時間至3個月，發(fā)現(xiàn)雙耳皆出現(xiàn)中、重度膜迷路積水，而且膜迷路積水從底轉(zhuǎn)開始［7］。本研究中，注射醛固酮組成功率89.4%（17/19），死亡率為5%（1/20），死亡原因不明。注射醛固酮誘發(fā)內(nèi)耳膜迷路積水的機(jī)制不明，推測與其通過作用鈉/鉀ATP酶活性，影響水鈉儲留有關(guān)。有研究表明，梅尼埃病患者血漿醛固酮并非增高［13］，筆者分析，其結(jié)果可能和梅尼埃病病程及臨床發(fā)作分期不明確有關(guān)。未來醛固酮與梅尼埃病相關(guān)性的研究值得重視，這對預(yù)防眩暈發(fā)作，控制發(fā)作癥狀有著重要的意義。本研究表明，分別利用血管加壓素和醛固酮皆可成功誘發(fā)并建立雙耳內(nèi)耳膜迷路積水的動物模型，證實這兩種激素參與內(nèi)淋巴積水的形成，注射醛固酮組成功率89.4%（17/19），注射血管加壓素組成功率73.7%（14/19），成功率在藥物組間有顯著性差異P＜0.05。兩組間死亡率相同。藥物組耳蝸積水程度重度21%（8/38），中度47.3%（18/ 38），輕度31.5%（12/38）。

一般認(rèn)為，梅尼埃病病因不明，其病理變化的形成機(jī)制與內(nèi)淋巴產(chǎn)生過多或吸收障礙有關(guān)。由于內(nèi)淋巴液在內(nèi)淋巴囊中吸收，推測內(nèi)淋巴囊功能受損，可以導(dǎo)致內(nèi)耳膜迷路積水。1965年，Kimura和Schuknecht［3，4］以此為據(jù)，首先報道通過手術(shù)破壞內(nèi)淋巴囊和內(nèi)淋巴管的方法，成功建立豚鼠內(nèi)耳膜迷路積水的動物模型，此后大量的實驗證明是接近梅尼埃病臨床的動物模型，作為傳統(tǒng)方法被一直采用。用同樣的方法建模，Kimura早期報告建立單耳膜迷路積水模型的成功率或致病率為97%，以后報告成功率或致病率皆為100%，建模的成功率與建模者的經(jīng)驗及操作技術(shù)有關(guān)，此方法是有效的建模手段。但在實驗建模的過程中，動物的死亡率及死亡原因一直未曾關(guān)注，由于此方法為切開硬腦膜，在硬腦膜內(nèi)建模，動物有合并死亡率的風(fēng)險，或可能犧牲更多動物生命。

在我們的早期研究中，皆采用Kimura方法進(jìn)行單耳建模，雖然建模成功率能達(dá)到100%［7］，動物死亡率60%以上，消耗大量動物，其主要原因包括術(shù)中乙狀竇致命性出血、小腦等結(jié)構(gòu)損傷；術(shù)后窒息、顱內(nèi)血腫、感染等。1989年，Andrews和Bohmer等人［14］對Kimura實驗建模方法進(jìn)行改良，通過硬膜外的方法手術(shù)破壞內(nèi)淋巴囊和內(nèi)淋巴管，誘發(fā)豚鼠內(nèi)耳膜迷路積水，降低了動物的死亡率。2010年，Megerian等人［15］對此方法進(jìn)行規(guī)范化操作示范。本研究中，我們選用改良Kimura硬膜外建模方法，在良好實驗條件下進(jìn)行建模，包括1）動物麻醉蘇醒過程保暖，氣道吸痰；2）在顯微鏡下使用電鉆操作，避免腦膜穿孔和周圍組織損傷；3）配用電凝器，暴露乙狀竇后預(yù)先電凝，避免術(shù)中損傷后再用骨蠟止血，減少術(shù)中出血、術(shù)后硬膜外血腫的機(jī)會；4）單獨喂養(yǎng)到傷口愈合，避免動物同類間互食。單側(cè)手術(shù)1月后成功建模，動物死亡率為15%（3/20），原因和麻醉后窒息、顱內(nèi)感染有關(guān)；雙側(cè)手術(shù)1月后成功建模，動物死亡率為75% （15/20），原因除和麻醉后窒息、顱內(nèi)感染有關(guān)外，主要和模型動物進(jìn)食困難有關(guān)。死亡率兩組之間有顯著差異。手術(shù)組總死亡率為45%（18/40），藥物組總死亡率為5%（2/40），有顯著性差異P＜0.01，因此，除非特殊實驗設(shè)計，即使是有手術(shù)經(jīng)驗的研究人員，盡量避免雙側(cè)手術(shù)建模。手術(shù)組耳蝸積水程度重度90.9%（20/22），中度18.1%（4/22），膜迷路積水從頂轉(zhuǎn)開始，和藥物組不同，兩組不同的原因?qū)⒃谝院筮M(jìn)一步詳細(xì)探討分析。

在未來廣泛而深入的研究中，膜迷路積水的動物模型不僅重要而且是基礎(chǔ)，通過手術(shù)的方法，建立單耳膜迷路積水模型，研究內(nèi)淋巴循環(huán)障礙導(dǎo)致膜迷路積水的可能機(jī)制，探尋內(nèi)淋巴囊減壓術(shù)的可能證據(jù)；通過醛固酮、血管加壓素等藥物方法，建立雙耳膜迷路積水模型，研究內(nèi)分泌代謝因素在膜迷路積水的可能機(jī)制中扮演的角色。研究分享建模經(jīng)驗不僅可以節(jié)約研究成本、珍惜動物生命，還可以提高建模效率和研究結(jié)論的科學(xué)性、準(zhǔn)確性，從而推動內(nèi)耳病的研究。

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Acomparative study of guinea pig models of endolymphatic hydrops

JIANG Zidong1，GAO Fan2，SUN Chengcheng1
1 Department of Otorhinolaryngology，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100730，China
2 Department of otorhinolaryngology，Capital Institute of Pediatrics Affiliated Children's Hospital，Beijing 100020，China Corresponding author：JIANG ZidongEmail：zidongjiangcn@aliyun.com

Objective To compare several approaches to establishing guinea pig models of endolymphatic hydrops.Methods Eighty guinea pigs were divided into four groups(20 each)to undergo single ear modeling,binaural modeling,aldosterone injection or vasopressin injection.Collodion and frozen sections of the inner ear were collected from surviving animals and examined under an optical microscope.The rates of animal survival and successful modeling,characteristics of cochlear hydrops,and effects of frozen or collodion sections on microscopic image studies were studied.Results Both monaural and binaural modeling was successful in all attempted animals(24/24),although the mortality rate was 15%(3/20)for monaural modeling and 75%(15/20)for binaural modeling(P<0.05).The successful modeling rate was 89.4%(17/19)for aldosterone injection and 73.7%(14/19)for vasopressin injection,with a mortality of 5%(1/20)in both injection groups (P<0.05).Total mortality rate in surgical models was 45%(18/40),higher than injection models(5%or 2/40) (P<0.01).In surgical modeling groups,endolymphatic hydrops in cochlea was rated profound in 20(83.3%) and moderate in 4(16.6%)of the 24 surviving animals,while hydrops in injection modeling groups was profound in 8(21%),moderate in 18(47.3%)and mild in 12(31.5%)of the 38 surviving animals,respectively. Both frozen and collodion sections yielded similar microscopy results.Conclusions Methods for endolymphatic hydrops animal models should be selected according to the specific requirements of the experimental design to save cost and improve study efficacy.

endolymphatic hydrops；guinea pig；model

·臨床研究·

R764.33

A

1672-2922（2015）04-742-6

2015-12-14審核人：吳子明）

基

DO金I：項10目.3：9國69家/j自.is然sn基.1金672-2922.2015.04.043NSFC-81441032，北京協(xié)和醫(yī)院中青年基金

蔣子棟，博士，主任醫(yī)生，研究方向：眩暈疾病診治和基礎(chǔ)研究

蔣子棟，Email：zidongjiangcn@aliyun.com