雌激素對(duì)模擬航天環(huán)境聽覺器官的保護(hù)作用

張馳　吳瑋，　韓浩倫　王剛　周麗斌　王鴻南　李保衛(wèi)　丁瑞英北京大學(xué)解放軍306醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院（北京000）解放軍306醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京000）

·基礎(chǔ)研究·

雌激素對(duì)模擬航天環(huán)境聽覺器官的保護(hù)作用

張馳1吳瑋1，2韓浩倫2王剛2周麗斌2王鴻南2李保衛(wèi)2丁瑞英2
1北京大學(xué)解放軍306醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院（北京100101）
2解放軍306醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100101）

目的探討模擬失重及飛船艙內(nèi)噪聲復(fù)合因素對(duì)大鼠聽覺電生理與超微結(jié)構(gòu)的影響，及雌激素對(duì)上述復(fù)合因素?fù)p傷的保護(hù)作用。方法32只SD大鼠隨機(jī)分為A、B、C3組，其中A組（失重+噪聲組）12只，B組（雌激素+失重+噪聲組）12只，C組（對(duì)照組）8只。A組、B組動(dòng)物均粘尾懸吊模擬失重，同時(shí)模擬飛船艙內(nèi)噪聲暴露8周，B組動(dòng)物在此基礎(chǔ)上每周兩次肌注苯甲酸雌二醇0.02mg/只，首劑加倍，至暴露結(jié)束。分別于暴露前、暴露后3天、1周、2周、4周、8周檢測其雙耳聽性腦干反應(yīng)閾值（ABR）。并于暴露結(jié)束后取耳蝸標(biāo)本進(jìn)行電鏡掃描。結(jié)果組內(nèi)對(duì)照，A組SD大鼠在暴露3天直至暴露8周后ABR閾值均較暴露前明顯增高（P＜0.01）；B組SD大鼠在暴露3天直至暴露8周后ABR閾值均較暴露前亦有所增高（P＜0.05）；C組SD大鼠在暴露2周較暴露1周ABR閾值有所提高（P＜0.05），其他時(shí)間點(diǎn)增高不顯著。組間對(duì)照，A組大鼠在暴露3天至暴露8周均較C組大鼠聽力顯著提高（P＜0.01）；B組大鼠在暴露3天至暴露8周較C組聽力無明顯提高（P＞0.05）；A組大鼠至暴露1周時(shí)較B組大鼠聽力升高不明顯，在以后時(shí)間點(diǎn)均較B組大鼠聽力明顯升高（P＜0.05）。掃描電鏡顯示A組損傷最重，B組損傷次之，C組未見異常。結(jié)論失重和噪聲復(fù)合因素可造成SD大鼠聽覺電生理及內(nèi)耳毛細(xì)胞的損傷，雌激素對(duì)失重和噪聲復(fù)合因素下的聽功能損傷具有一定保護(hù)作用。

模擬失重；噪聲；聽性腦干反應(yīng)；雌激素

宇航員在太空中執(zhí)行任務(wù)時(shí)，面臨許多與地面不同的情況。如失重狀態(tài)，穩(wěn)態(tài)噪聲的持續(xù)暴露等等。穩(wěn)態(tài)噪聲和失重狀態(tài)對(duì)宇航員來說是持續(xù)存在。它會(huì)對(duì)人體造成耳鳴、聽力下降的不良影響［1］，一旦發(fā)生，會(huì)大大影響宇航員以后的工作效率及生活質(zhì)量。雌激素是一種由內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的類固醇性激素，它在多個(gè)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用［2］。在聽力損傷的保護(hù)作用方面也逐漸被重視。既往本課題組發(fā)現(xiàn)大鼠處于模擬載人航天環(huán)境5天后會(huì)對(duì)聽功能造成損傷，雌激素對(duì)造成的損傷具有一定的保護(hù)作用［3］，但隨著載人航天事業(yè)的發(fā)展以及人類在宇宙中停留時(shí)間的延長，關(guān)于中長期載人航天環(huán)境對(duì)人類聽力學(xué)影響的研究仍是空缺，本文主要觀察中長期飛船艙內(nèi)噪聲和失重復(fù)合環(huán)境下大鼠聽性腦干反應(yīng)和掃描電鏡內(nèi)外毛細(xì)胞的變化以及雌激素對(duì)噪聲暴露后大鼠聽力損傷的保護(hù)作用。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康SD大鼠32只（北京海淀區(qū)興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場提供），均為雄性，體重180～220g，耳廓反應(yīng)靈敏，鼓膜標(biāo)志清晰，無強(qiáng)噪聲暴露及耳毒性藥物使用史，隨機(jī)分為正常對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組。正常對(duì)照組8只（C組），實(shí)驗(yàn)組24只。其中實(shí)驗(yàn)組又分為A、B兩組，每組12只。均于暴露八周后取材。A組（噪聲+失重組）同時(shí)給予噪聲暴露和模擬失重處理，B組（雌激素+噪聲+失重組）在給予噪聲暴露和模擬失重處理的情況下，同時(shí)給予雌激素腹腔注射，C組（對(duì)照組）未給予任何處理。實(shí)驗(yàn)前所有動(dòng)物進(jìn)行聽性腦干反應(yīng)（ABR）閾值測試，對(duì)照組和兩實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物ABR閾值未見明顯差異。

1.2雌激素給藥方法

苯甲酸雌二醇注射液由天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)。B組于噪聲暴露和模擬失重處理當(dāng)天給予雌激素注射，首次注射劑量0.04mg/只，以后每周注射兩次，劑量為0.02mg/只。

1.3模擬失重方法

參考大鼠粘尾懸吊法［4］，采用頭低位模擬失重法。懸吊大鼠尾部使其后肢離地，膠布固定于尾部，留出活結(jié)，用鐵絲懸吊，前肢承受部分重量，頭低位身體縱軸與水平線呈-30°，懸吊中大鼠可以自由進(jìn)食水，頭部活動(dòng)自由，持續(xù)時(shí)間較長，總計(jì)懸吊8周。

1.4噪聲暴露方法

穩(wěn)態(tài)噪聲由白噪聲信號(hào)發(fā)生器（UZ-3型），經(jīng)均衡器（MEQ），功率放大器（PA-1000）傳到揚(yáng)聲器（YZ20-7），并將揚(yáng)聲器放置于大鼠籠前部。噪聲聲級(jí)用BK2250手持式分析儀測量，測得其聲壓級(jí)為（72±2）dB SPL，每天持續(xù)給予9小時(shí)穩(wěn)態(tài)噪聲暴露。

1.5聽性腦干反應(yīng)（ABR）閾值測試

實(shí)驗(yàn)SD大鼠用咪唑安定（80mg/kg）和鹽酸賽拉嗪注射液（200mg/kg）進(jìn)行肌肉注射麻醉（麻醉深度達(dá)角膜反射消失）。實(shí)驗(yàn)前對(duì)A、B、C三組應(yīng)用聽性腦干反應(yīng)儀（MEDSEN丹麥）檢測短聲誘發(fā)的雙側(cè)聽性腦干反應(yīng)閾值，并分別于暴露后3天、1周、2周、4周、8周再次進(jìn)行檢測。記錄電極置于前額正中皮下，參考電極置于對(duì)側(cè)耳后乳突區(qū)皮下，接地電極置于鼻尖。從高聲強(qiáng)開始，依次以20、10、5dB SPL逐漸衰減，以能誘發(fā)出可辨認(rèn)波Ⅲ的最低強(qiáng)度為反應(yīng)閾，在閾值強(qiáng)度重復(fù)檢測1次。

1.6掃描電鏡檢查

掃描電鏡（Scanning Electron Microscopy，SEM）檢查：A、B、C三組SD大鼠在暴露8周后，快速斷頭處死并迅速取出耳蝸，2.5%戊二醛固定液進(jìn)行離體耳蝸灌注。固定4h后，采用硬剝法暴露出基底膜。處理后的內(nèi)耳標(biāo)本進(jìn)行脫水、干燥、鍍金等處理。掃描電鏡（Hitachi S4800）下觀察，拍照。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，各組各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)ABR閾值采用方差分析。

2　結(jié)果

表1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不同時(shí)間點(diǎn)ABR閾值的變化

2.1實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物不同時(shí)間點(diǎn)ABR閾值的變化（見表1）

2.1.1三組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)ABR閾值變化：A組（噪聲+失重組）SD大鼠暴露3天直至8周ABR閾值均較暴露前有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。B組（雌激素+噪聲+失重組）SD大鼠暴露3天直至8周ABR閾值均較暴露前有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。C組（對(duì)照組）SD大鼠暴露3天、1周較暴露之前無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），暴露2周較暴露1周有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），暴露4周較暴露2周、暴露8周較暴露4周無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.1.2實(shí)驗(yàn)開始之前，三組之間ABR閾值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.614）。A組在暴露3天至暴露8周較C組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），B組在暴露3天至暴露8周較C組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），A組至暴露1周時(shí)與B組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），余各時(shí)間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。

圖1　、2為A組，圖3、4為B組，圖5、6為C組

2.2掃描電鏡檢查結(jié)果

2.2.1A組（噪聲+失重組）：1圖示內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛缺失、倒伏、融合。外毛細(xì)胞可見缺失。2圖示內(nèi)、外毛細(xì)胞靜纖毛可見片狀缺失。

2.2.2B組（雌激素+噪聲+失重組）：3、4圖示內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛部分缺失、倒伏、融合，較A組損傷輕。外毛細(xì)胞大致正常。

2.2.3C組（對(duì)照組）：5、6圖示內(nèi)外毛細(xì)胞靜纖毛未見明顯異常。

2.2.4各組之間比較：掃描電鏡顯示A組損傷最重，B組損傷次之，C組未見明顯損傷。

3　討論

在載人航天過程中，穩(wěn)態(tài)噪聲和失重是持續(xù)存在的。研究表明［5］噪聲是最主要的損害人類聽覺系統(tǒng)的因素，可造成永久性聽力損失，一旦發(fā)生，將縮短宇航員的職業(yè)壽命，因此研究航天性聽損傷對(duì)現(xiàn)實(shí)有重要意義。失重，作為宇航員在宇宙中的一種長期持續(xù)狀態(tài)，亦可對(duì)身體的各個(gè)器官產(chǎn)生不同的影響，包括人的聽覺器官［6-7］。故為更好的服務(wù)于載人航天事業(yè)，遂模擬飛船艙內(nèi)穩(wěn)態(tài)噪聲及失重狀態(tài)進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。

既往本課題組曾短期模擬飛船艙內(nèi)失重及噪聲復(fù)合因素并研究其對(duì)豚鼠聽力的影響，發(fā)現(xiàn)短期模擬飛船艙內(nèi)復(fù)合因素會(huì)對(duì)大鼠聽力造成損傷。本實(shí)驗(yàn)對(duì)ABR閾值進(jìn)行觀測，3天時(shí)A組大鼠聽力較暴露前有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與既往研究相符。此外，A組大鼠ABR閾值隨著暴露時(shí)間的延長顯著增高。A組大鼠較C組大鼠ABR閾值顯著增高?？芍L期模擬復(fù)合因素對(duì)大鼠聽力造成損傷，且隨時(shí)間延長損傷加重。而C組大鼠ABR閾值隨著時(shí)間延長亦在增加?？紤]可能與反復(fù)麻醉測聽有關(guān)，亦考慮可能與鼠齡增長的影響，這方面有待進(jìn)一步研究。但各組間干擾因素均相一致，故對(duì)研究結(jié)果無影響。Chen等［8］研究指出，噪聲性聽功能損失與毛細(xì)胞缺失密切相關(guān)，這種關(guān)聯(lián)可能提示實(shí)驗(yàn)中受損的毛細(xì)胞死亡。過度的噪聲刺激將導(dǎo)致耳蝸外毛細(xì)胞（OHC）和內(nèi)毛細(xì)胞（IHC）的損傷或丟失，造成暫時(shí)性閾移或永久性閾移。既往有研究發(fā)現(xiàn)失重狀態(tài)與穩(wěn)態(tài)噪聲復(fù)合因素對(duì)內(nèi)耳內(nèi)外毛細(xì)胞會(huì)造成嚴(yán)重?fù)p傷［9］。從本實(shí)驗(yàn)掃描電鏡結(jié)果中可看出A組大鼠較C組大鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷嚴(yán)重，而C組大鼠未見明顯異常。均證實(shí)模擬飛船艙內(nèi)失重及穩(wěn)態(tài)噪聲會(huì)對(duì)聽力系統(tǒng)造成損害。

雌激素是一種由內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的類固醇性激素，它在多個(gè)系統(tǒng)如心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用［2］。雌激素能影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，并具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)聽覺器官亦有非常重要的保護(hù)作用［10］。有研究發(fā)現(xiàn)雌激素促進(jìn)風(fēng)洞致使的噪聲性聾的恢復(fù)［11］。此外，耳蝸內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了雌激素受體的存在［12-13］，提示其可能對(duì)聽功能損傷具有一定的防護(hù)作用。曾經(jīng)有調(diào)查發(fā)現(xiàn)，老年男性（70-75歲）比同齡女性高頻聽力降低約10dB-25dB［14］。絕經(jīng)期后女性更容易出現(xiàn)聽力下降，而男性出現(xiàn)聽力下降的時(shí)間較女性早［15］，考慮這些差異與內(nèi)源性雌激素水平有關(guān)。本課題組既往研究也發(fā)現(xiàn)雌激素對(duì)豚鼠聽力損傷有預(yù)防和治療作用。本實(shí)驗(yàn)中A組大鼠較C組大鼠ABR閾值均增高顯著，B組大鼠較C組大鼠ABR閾值增高不顯著，A、B兩組大鼠在1周后有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，均可證明雌激素對(duì)豚鼠聽力有保護(hù)作用，符合既往研究。而在3天、1周時(shí)，A、B兩組大鼠之間無明顯差異，考慮可能與雌激素起效時(shí)間及血藥濃度有關(guān)，具體機(jī)制尚不完全明確，有待進(jìn)一步研究。掃描電鏡檢查示復(fù)合因素暴露8周后，A、B組大鼠內(nèi)毛、細(xì)胞靜纖毛均可見損傷，A組損傷較重，且A組大鼠外毛細(xì)胞亦有損傷。而C組大鼠內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛、外毛細(xì)胞靜纖毛無明顯損傷。電鏡結(jié)果與聽力測試結(jié)果基本相符。說明雌激素確實(shí)有保護(hù)聽力損傷作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功模擬飛船艙內(nèi)的失重及噪聲復(fù)合因素，從聽覺電生理學(xué)及電鏡改變兩方面證實(shí)了失重及噪聲復(fù)合因素對(duì)SD大鼠聽器官有明確損傷作用；并通過給予雌激素注射使聽力得以保護(hù)，為雌激素對(duì)噪聲性耳聾的保護(hù)提供了理論依據(jù)。但雌激素保護(hù)聽覺系統(tǒng)的具體機(jī)制，目前尚不明確，需要我們今后進(jìn)一步研究。

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Protective Effects of Estrogen on Cochlea during Mid-Long Term Simulated Manned Spacecraft Environment

ZHANG Chi1，WU Wei1.2，HAN Haolun2，WANG Gang2，ZHOU Libin2，WANG Hongnan2，LI Baowei2，DING Ruiying2
1 PLA 306th Hospital/Peking University Teaching Hospital，Beijing 100101.
2 Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery，PLA 306th Hospital，Beijing 100101 Corresponding author：WU WeiEmail：entwuwei@126.com

Objective To study the effects of compound factors of weightlessness and noise in spaceship on rat hearing and cochlear morphology,as well as protection against auditory damage by estrogen.Methods Thirty two SD rats were randomly divided into groups A and B(n=12 each)and group C(n=8)Animals in groups A and B were subjected to glued tail suspension to simulate weightlessness,and exposed to simulated spaceship noise for 8 weeks.Additionally,animals in group B were injected with 0.02 mg benzoate twice a week(first dose=0.04 mg)until the end of the experiment.Auditory brainstem response(ABR)thresholds were tested bilaterally before and at 3 days,1 week,2 weeks,4 weeks and 8 weeks after noise exposure.The cochlea was harvested and processed for scanning electron microscopy(SEM)studies at the end.Results ABR thresholds were significantly higher in group A than other groups(P<0.01).The longer the exposure,the higher the thresholds.ABR thresholds in group B were also increased along with noise exposure(P<0.05).ABR thresholds in group C increased along with noise exposure from week 1 to week 2(P<0.05),but not significantly at other time points (P>0.05).ABR thresholds in group A were higher than in group C at all times(P<0.01).ABR thresholds in group B were not significantly different than in group C from day 3 to 8 weeks.(P>0.05).ABR thresholds in groupAwere not significantly different from group B during the 1st week,but higher than group B at other time points(P<0.05).SEM showed the most severe cochlear damage in group A,followed by group B.Only mild cochlear change was observed in group C.Conclusions Simulated weightlessness and noise exposure can cause damage to hearing and changes of cochlear morphology in SD rats.Estrogen appears to protect against such damages.

Simulated weightlessness；Noise；Auditory brainstem response；Estrogen

R764.433

A

1672-2922（2015）04-746-4

2015-10-27審核人：郭維維）

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.04.044

全軍十二五重大課題子課題（AWS11J003）

張馳，研究生在讀，住院醫(yī)師，研究方向：特種耳科學(xué)及臨床

吳瑋，Email：entwuwei@126.com