晚期糖基化終末產(chǎn)物受體與核因子-κβ在中耳膽脂瘤中的表達(dá)

廖軍　林昶福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院耳鼻喉科（泉州362000）福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科（福州350000）

·基礎(chǔ)研究·

晚期糖基化終末產(chǎn)物受體與核因子-κβ在中耳膽脂瘤中的表達(dá)

廖軍林昶
福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院耳鼻喉科（泉州362000）
福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科（福州350000）

目的研究中耳膽脂瘤中核因子-κβ（NF-κβ）與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）的表達(dá)，探究上皮炎癥反應(yīng)在膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制中的作用，尋找可能的中耳膽脂瘤干預(yù)治療措施。方法中耳膽脂瘤手術(shù)中收集中耳膽脂瘤標(biāo)本23例及正常外耳道皮膚組織18例，采用免疫組化法檢驗兩種標(biāo)本中NF-κβ和RAGE表達(dá)分布。結(jié)果膽脂瘤上皮組織中NF-κβ表達(dá)強(qiáng)度顯著高于正常外耳道皮膚組織，兩者NF-κβ陽性平均光密度分別為0.442±0.060及0.293±0.047（t=8.654，P＜0.01）；膽脂瘤上皮組織中RAGE表達(dá)強(qiáng)度顯著高于正常外耳道皮膚組織，兩者RAGE陽性平均光密度分別0.175±0.017及0.133±0.013（t= 8.516，p＜0.01）。膽脂瘤上皮NF-κβ與RAGE表達(dá)具有弱相關(guān)性r=0.546（P=0.034）。結(jié)論NF-κβ與RAGE在中耳膽脂瘤上皮中表達(dá)增加，可能在膽脂瘤的發(fā)生和持續(xù)發(fā)展中起重要作用。調(diào)控NF-κβ與RAGE信號傳導(dǎo)通路可能是中耳膽脂瘤治療干預(yù)的有效靶點之一。

中耳膽脂瘤；核因子-κβ；晚期糖基化終末產(chǎn)物受體

中耳膽脂瘤是一種來源于角化復(fù)層鱗狀上皮的囊性病變，上皮過度角化產(chǎn)生雜亂無章的角蛋白纖維層層堆積，刺激周圍組織發(fā)生炎癥反應(yīng)包裹形成囊性腫物，并侵襲周圍組織引起骨質(zhì)破壞，最終導(dǎo)致聽力損失、前庭功能障礙，并能引起嚴(yán)重的顱內(nèi)外并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅人類健康。目前關(guān)于中耳膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制眾說紛紜，但其上皮組織中發(fā)生的慢性炎癥反應(yīng)被廣泛認(rèn)為是其中重要的始動和促進(jìn)因素。膽脂瘤病變擴(kuò)大，乃至破壞周圍相關(guān)骨質(zhì)與異常的免疫反應(yīng)關(guān)系密切，這一過程離不開多種炎癥因子介導(dǎo)［1，2］，膽脂瘤中表達(dá)異常增高的白細(xì)胞介素1、6、8及腫瘤壞死因子等導(dǎo)致了膽脂瘤的上皮增殖凋亡、骨質(zhì)破壞吸收。這些炎癥因子調(diào)控與釋放與核因子表達(dá)有關(guān)。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體作為機(jī)體炎癥反應(yīng)發(fā)動的多條信號通路的啟動靶點，在糖尿病并發(fā)癥、動脈粥樣硬化、原發(fā)性高血壓等疾病的發(fā)生發(fā)展中的作用經(jīng)過越來越多的研究得以證實［3，4］，相應(yīng)的信號通路的特異性和復(fù)雜性也逐漸為人所知。但在中耳膽脂瘤這一領(lǐng)域，相關(guān)的研究還未見諸報道。本研究采用免疫組化方法檢測中耳膽脂瘤中RAGE以及NF-κβ的表達(dá)分布，以深入闡明中耳膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找膽脂瘤非手術(shù)干預(yù)治療的可能的藥物靶點。

1　材料與方法

1.1病例選擇

選取福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院耳鼻喉科2012-2013年因中耳膽脂瘤行手術(shù)的患者23人，留取中耳膽脂瘤組織標(biāo)本23例。膽脂瘤組織術(shù)后HE染色證實原診斷無誤，且均含膽脂瘤上皮組織。其中男性11人（11耳），女性12人（12耳），年齡17-58歲，平均39.3歲。耳流膿史3個月-15年，平均2.6年。復(fù)發(fā)者1人。對照組織選取正常外耳道皮膚18例，于手術(shù)同期取得。所有標(biāo)本行常規(guī)石蠟包埋并切片用作HE染色及免疫組化染色。

1.2主要試劑及來源

鼠抗人RAGE、NF-κβp65抗體為美國Sanda Cruz公司產(chǎn)品，購自上海億欣生物科技有限公司；ElivisionTM Plus試劑盒，抗原修復(fù)試劑：0.01mmol/L檸檬酸型緩沖液購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3檢測RAGE、NF-κβ在組織中的表達(dá)

采用ElivisionTM Plus法檢測中耳膽脂瘤上皮及正常外耳道皮膚組織中RAGE、NF-κβ的蛋白表達(dá)和分布。NF-κβ單抗稀釋比例為1：100，RAGE單抗稀釋比例為1：200。具體步驟按ElivisionTM Plus檢測說明書進(jìn)行操作。RAGE以胞膜、胞質(zhì)或胞核著色，著色部分出現(xiàn)清晰棕黃色或棕黑色為陽性細(xì)胞，NF-κβ以胞質(zhì)或胞核著色，著色部分出現(xiàn)清晰棕黃色為陽性細(xì)胞。觀察陽性著色部位并采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件對染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析。每張切片任意選取上皮組織5個陽性清晰顆粒、無非特異性背景著色的部位為代表性部位，在400倍顯微視野下測定其中陽性細(xì)胞的陽性染色面積及累計光密度值并計算平均光密度（MOD），取5個代表性部位MOD值的平均值作為該切片的上皮組織的MOD值。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用兩組獨立樣本t檢驗比較膽脂瘤標(biāo)本中上皮組織與正常外耳道皮膚表皮組織中RAGE、NF-κβ蛋白表達(dá)的差異。采用相關(guān)分析探究膽脂瘤上皮組織中NF-κβ及RAGE是否存在相關(guān)性。

2　結(jié)果

2.1組織標(biāo)本中NF-κβ蛋白表達(dá)

41例標(biāo)本免疫組化染色均有NF-κβ蛋白的陽性表達(dá)。在23例膽脂瘤組織中，NF-κβ陽性細(xì)胞分布于上皮全層，多數(shù)標(biāo)本呈強(qiáng)陽性表達(dá)（見圖1）。23例標(biāo)本均有胞質(zhì)染色，有8例標(biāo)本上皮細(xì)胞中出現(xiàn)胞核陽性著色。18例正常外耳道皮膚組織標(biāo)本可見表皮弱陽性表達(dá)，均為胞質(zhì)染色（見圖2）。

圖1　膽脂瘤上皮NF-κβp65高表達(dá)×400倍

圖2　正常皮膚NF-κβp65低表達(dá)×400倍

膽脂瘤上皮組織NF-κβ陽性平均光密度為0.442±0.060，正常外耳道皮膚組織表皮NF-κβ陽性平均光密度為0.293±0.047，兩者平均光密度具有顯著性差異（t=8.654，P＜0.01）（見表1）。

表1　膽脂瘤組織標(biāo)本NF-κβ蛋白表達(dá)

2.2組織標(biāo)本中RAGE表達(dá)

41例標(biāo)本免疫組化染色均有RAGE的陽性表達(dá)，主要位于上皮組織，細(xì)胞膜細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)明顯，偶有胞核表達(dá)（見圖3、圖4）。膽脂瘤上皮組織中RAGE陽性平均光密度為0.175±0.017，正常外耳道皮膚表皮RAGE陽性平均光密度為0.133±0.013，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.516，P＜0.01）（見表2）。

圖3　膽脂瘤上皮RAGE高表達(dá)×400倍

圖4　正常皮膚RAGE低表達(dá)×400倍

表2　膽脂瘤組織標(biāo)本中RAGE表達(dá)

2.3組織標(biāo)本中NF-κβ與RAGE表達(dá)相關(guān)性

經(jīng)過Spearman分析，膽脂瘤上皮中NF-κβ與RAGE表達(dá)的相關(guān)性r=0.546（p=0.034），具有弱相關(guān)性，正常外耳道皮膚表皮NF-κβ與RAGE表達(dá)r= 0.235（p=0.348），不具有相關(guān)性（見表3、4）。

表3　

表4　

3　討論

中耳膽脂瘤是一種囊性病變，其生物學(xué)來源為角化的復(fù)層鱗狀上皮。過度角化的上皮產(chǎn)生層層堆積的雜亂無章的角蛋白纖維，周圍組織受到刺激發(fā)生炎癥反應(yīng)增生包裹角蛋白堆積物，形成囊性腫物逐漸膨大，侵襲周圍組織引起骨質(zhì)壓迫吸收，最終導(dǎo)致聽骨鏈破壞、聽力喪失與前庭功能障礙，更有甚者會引起嚴(yán)重的顱內(nèi)外并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅人類健康。膽脂瘤上皮組織局部微環(huán)境包括免疫細(xì)胞等受到多種內(nèi)、外源性刺激，產(chǎn)生炎性介質(zhì)級聯(lián)式反饋作用，使組織中炎癥反應(yīng)逐步加重。多層基質(zhì)（角化上皮）和免疫細(xì)胞及周邊基質(zhì)（如肉芽組織）混雜在一起是膽脂瘤的主要組織學(xué)特征。免疫機(jī)制的反復(fù)正反饋保持并增強(qiáng)了膽脂瘤上皮的增殖潛能。本研究通過對中耳膽脂瘤標(biāo)本中RAGE、NF-κβ表達(dá)的檢測，希望能夠進(jìn)一步明確病變發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，從而有效控制中耳膽脂瘤的發(fā)展。

作為一種跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，RAGE是免疫球蛋白大家族中的一員。RAGE具有多種配體，是機(jī)體炎癥反應(yīng)發(fā)動的多條信號通路的啟動靶點。不同細(xì)胞表面的RAGE通過與多種配體結(jié)合發(fā)揮功效，能夠向細(xì)胞內(nèi)傳遞不同的信息，使得細(xì)胞對不同的刺激做出相應(yīng)的反應(yīng)。細(xì)胞中的RAGE的表達(dá)在正常生理狀態(tài)下較低，而應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞可觀察到RAGE表達(dá)明顯增高。經(jīng)還原輔酶1 （NADPH）氧化酶介導(dǎo)，RAGE與AGEs結(jié)合會引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生，活性氧簇（ROS）隨之增多［12］。氧自由基在細(xì)胞內(nèi)生成后可使細(xì)胞膜發(fā)生超氧化；也可造成細(xì)胞內(nèi)的活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)等的直接損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞的結(jié)構(gòu)改變、功能失調(diào)、代謝異常，甚至誘發(fā)細(xì)胞凋亡。RAGE與配體結(jié)合后還可以激活細(xì)胞內(nèi)包括cdc42/rac，p21ras，MAPK和NF-κβ等［13-15］重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。MAPK通路的激活促進(jìn)了細(xì)胞的增殖、浸潤，這與基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的活化有關(guān)［13］。在氧化應(yīng)激產(chǎn)物、MAPK通路激活產(chǎn)物作用下，NF-κβ被激活，使得炎癥信號繼續(xù)沿著傳導(dǎo)通路向下游傳遞，細(xì)胞得以表達(dá)相應(yīng)的功能蛋白。Bierhal等［14］發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的RAGE與各種AGEs結(jié)合后，在體內(nèi)外均可引起NF-κβ增加（實驗中觀察到p65mRNA和抗原表達(dá)水平提高），NF-κβ持續(xù)活化。而NF-κβ的活化，能夠?qū)е露喾N細(xì)胞因子的形成與釋放，引起復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)。其中包括大量炎癥性細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放，這將會導(dǎo)致炎癥的進(jìn)一步持續(xù)和加重［16，17］。本研究通過免疫組化的檢測發(fā)現(xiàn)，中耳膽脂瘤標(biāo)本中RAGE的表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示了RAGE的大量沉積或基因表達(dá)是中耳膽脂瘤疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)因素之一。

NF-κβ是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，多種炎癥和免疫基因表達(dá)都受到其調(diào)控。生理狀態(tài)下，NF-κβ存在于細(xì)胞的胞質(zhì)中并不具有生物學(xué)活性；當(dāng)受到各種胞內(nèi)胞外因素的活化時，才被激活從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核，啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄［18，19］。NF-κβ對炎癥基因的表達(dá)調(diào)控中位于多條信號通路的交匯點，因此絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為NF-κβ通路是典型的炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。目前體內(nèi)外實驗觀察到有多種細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境刺激因素可以激活NF-κβ。蛋白磷酸化和蛋白水解是NF-κB激活的細(xì)胞內(nèi)信號途徑主要環(huán)節(jié)［20］，無活性的NF-κB以p105構(gòu)成的二聚體及p50-p65-IκB構(gòu)成的三聚體的形式存在，NF-κB的核位置信號區(qū)未能暴露，當(dāng)細(xì)胞外刺激信號通過激活磷酸激酶C，分別磷酸化抑制性亞單位IκB和p105；IκB結(jié)構(gòu)磷酸化后與具有活性p50-p65異構(gòu)二聚體解離，而磷酸化的p105單位隨即被蛋白酶水解成p50亞單位，使p105二聚體轉(zhuǎn)化為p50-p65異構(gòu)二聚體產(chǎn)生活性，這樣蛋白磷酸化和蛋白水解使NF-κB的核位置信號區(qū)暴露，促使NF-κB從細(xì)胞核外進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮核基因調(diào)控作用。激活的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后與靶基因結(jié)合，使該處的DNA呈現(xiàn)構(gòu)象變化，從而對靶基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行啟動或增強(qiáng)［21］。NF-κβ作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與多種細(xì)胞內(nèi)外信號傳導(dǎo)，調(diào)控病理過程中多種相關(guān)因子的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄［22］。NF-κβ可以調(diào)控多種炎癥因子靶基因的表達(dá)，當(dāng)NF-κβ激活后炎癥相關(guān)因子的表達(dá)增加，引起炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。目前證明與NF-κβ密切相關(guān)的炎癥疾病有腎小球腎炎、感染性休克、炎癥性腸病、全身性炎癥反應(yīng)綜合征、幽門螺旋桿菌相關(guān)性胃炎等。在許多炎癥疾病中NF-κβ激活后產(chǎn)生強(qiáng)化正反饋而使炎癥信號持續(xù)傳導(dǎo)造成病情進(jìn)展。有實驗表明NF-κB還具有調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用［23-24］。本研究發(fā)現(xiàn)中耳膽脂瘤標(biāo)本上皮全層NF-κβ均有表達(dá)，且顯著強(qiáng)于正常皮膚組織，部分膽脂瘤上皮出現(xiàn)明顯的胞核NF-κβ陽性反應(yīng)，說明NF-κβ在膽脂瘤中存在異常表達(dá)，可能在中耳膽脂瘤的發(fā)生和持續(xù)發(fā)展中起重要作用。

RAGE與NF-κβ之間也存在相互作用，兩者通過復(fù)雜的信號傳導(dǎo)通路共同調(diào)節(jié)細(xì)胞功能狀態(tài)。RAGE與配體結(jié)合后細(xì)胞外信號傳導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)由MAPK通路或活化NADPH氧化酶使得細(xì)胞內(nèi)活性氧簇水平升高［25-28］，成為NF-κβ信號通路上游信號來源，通過NF-κβ將信號傳導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi)，核內(nèi)基因表達(dá)啟動或增強(qiáng)，促進(jìn)炎癥的發(fā)生；RAGE基因也屬于NF-κβ調(diào)節(jié)的核內(nèi)靶基因，NF-κβ入核也將引起RAGE表達(dá)的增加，兩者互為信號通路的上下游，在病理狀態(tài)下反復(fù)強(qiáng)化，將導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的長期持續(xù)，疾病破壞的進(jìn)一步加重。本研究表明中耳膽脂瘤中RAGE與NF-κβ表達(dá)具有弱相關(guān)性，并不能明確兩者在中耳膽脂瘤中因果關(guān)系。這可能是由于細(xì)胞內(nèi)信號通路的復(fù)雜性以及檢測的半定量分析引入的系統(tǒng)混雜因素造成的，但二者在中耳膽脂瘤中的共同高表達(dá)提示了炎癥反應(yīng)在中耳膽脂瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，抗炎抗氧化應(yīng)激治療有可能成為中耳膽脂瘤的一個新的治療思路。如果可以抑制機(jī)體異常持續(xù)的炎癥反應(yīng)，那么就有可能通過非手術(shù)方法控制中耳膽脂瘤炎性碎屑的堆積，減少骨質(zhì)破壞，緩解病情，為中耳膽脂瘤的防治開辟新途徑。

4　結(jié)論

本研究通過對中耳膽脂瘤標(biāo)本及正常外耳道皮膚的免疫組化檢測，探究中耳膽脂瘤RAGE以及NF-κβ的表達(dá)分布特點，分析炎癥信號通路在中耳膽脂瘤疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用。研究結(jié)果表明，中耳膽脂瘤中RAGE以及NF-κβ的表達(dá)較正常外耳皮膚有顯著的升高，集中表現(xiàn)于中耳膽脂瘤上皮。炎癥反應(yīng)是中耳膽脂瘤發(fā)生持續(xù)發(fā)展并造成嚴(yán)重組織破壞的重要因素之一。

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Expression of receptors for advanced glycation end product(RAGE)and nuclear factor-κβ(NF-κβ)in middle ear cholesteatoma

LIAO Jun，LIN Chang
Department of Otorhinolaryngology，Quanzhou First Hospital，F(xiàn)ujian Medical University，362000，Quanzhou
Department of Otorhinolaryngology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，F(xiàn)ujian Medical University，350000，F(xiàn)uzhou，Corresponding author：LIN ChangEmail：linc301@yahoo.com

Objective To study the roles of NF-κβand RAGE in the pathogenesis of middle ear cholesteatoma.Methods Samples of middle ear cholesteatoma(n=23)and normal external ear canal skin(n=18)were collected during middle ear surgeries.Expression of NF-κβand RAGE was examined by immunohistochemistry.Results All epithelial cells in cholesteatoma revealed abundant plasma expression of NF-κβ and RAGE, significantly higher than that in normal skin(0.442±0.060 vs 0.293±0.047 and 0.175±0.017 vs 0.133±0.013, respectively;p<0.01).There was a weak correlation between NF-κβ and RAGE expression in middle ear cholesteatoma epithelium tissues(r=0.546,p=0.034).Conclusion NF-κβ and RAGE may be important factors involved in the occurrence and development of middle ear cholesteatom.The signal pathway of RAGE and NF-κβ may be a new drug target in non-surgical treatment of middle ear cholesteatoma.

middle ear cholesteatoma；NF-κβ；RAGE

R764.2

A

1672-2922（2015）04-737-5

2015-10-8審核人：郭維維）

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.04.042

泉州市社會發(fā)展科技計劃項目（2013Z60），并獲泉州市衛(wèi)生局資助。

廖軍，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：耳科學(xué)

林昶，Email：linc301@yahoo.com