非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織中EGFR、K-Ras和BRAF基因突變的分子病理檢測分析

宋業(yè)穎，許春偉，吳永芳，班 怡，張 博，李曉兵

肺癌的發(fā)病率和死亡率逐漸攀升，已躍居惡性腫瘤之首，肺癌患者中有80%以上為非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)，而且確診時(shí)約60%為晚期患者［1-6］。盡管在化療、放療等綜合治療手段上有很大改進(jìn)，但總體療效已達(dá)瓶頸，其總的5年生存率仍低于20%［6-8］。近年來針對表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的靶向藥物已經(jīng)成功應(yīng)用于NSCLC治療，很大程度上延長了患者的生存時(shí)間和改善了生活質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)部分患者對以 Gefitibib、Erlotinib、Icotinib和 Afatinib藥物為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)治療效果敏感。EGFR體細(xì)胞突變對Gefitibib和Erlotinib藥物治療后的潛在臨床反應(yīng)起決定作用，EGFR基因結(jié)構(gòu)域的3個(gè)外顯子(外顯子18、19和21)發(fā)生突變的患者對EGFR-TKI藥物的反應(yīng)性更好，而EGFR基因外顯子20發(fā)生突變、K-Ras基因外顯子12、13和61以及BRAF基因V600E發(fā)生突變的患者對EGFR-TKI藥物的反應(yīng)性差［9-11］。本研究通過直接測序法獲得基因突變類型，分析 NSCLC患者 EGFR基因、K-Ras基因和BRAF基因突變情況，為判斷疾病發(fā)展過程、預(yù)后及EGFR-TKI靶向治療提供分子病理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般材料:收集軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院2011年1月—2014年3月經(jīng)手術(shù)切除、穿刺活檢及會(huì)診NSCLC標(biāo)本550例。

1.1.2 主要試劑和儀器:FFDE樣本DNA分離試劑盒購自福建廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司，核酸蛋白質(zhì)濃度測量儀B-500購自上海創(chuàng)萌生物科技有限公司，Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國Stratagene公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取:采用福建廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司的FFPE樣本DNA分離試劑盒提取組織，比照蘇木精－伊紅染色(HE)在顯微鏡下標(biāo)記腫瘤區(qū)域，切片過程中僅選取相關(guān)腫瘤區(qū)域，將含有腫瘤區(qū)域的DNA組織的蠟塊10 μm厚連續(xù)切片5張，嚴(yán)格按照試劑盒說明步驟進(jìn)行操作。DNA提取后應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測量DNA質(zhì)量及濃度。按照測量的DNA濃度稀釋至2～5 mg/L備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增:PCR反應(yīng)體系(50 μl):2×Taq PCR Master Mix 25 μl;DNA 模板 2 μl;上、下游引物各2 μl(10 pmol);滅菌去離子水19 μl。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 5 min;94℃、30 s，56℃、45 s，72℃、1 min，共45 個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min，4℃冷卻5 min。滅菌去離子水代替模板作為陰性對照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京迪諾基因科技有限公司純化并測序，有突變的病例再行反向測序證實(shí)，確定基因突變類型。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因突變分析 550例NSCLC共204例(37.09%)檢測到 EGFR基因突變，其中8例(1.45%)檢測到EGFR基因18外顯子突變;116例(21.09%)檢測到EGFR基因19外顯子突變;20例(3.64%)檢測到EGFR基因20外顯子突變;61例(11.09%)檢測到EGFR基因21外顯子突變，見表1。EGFR基因各外顯子之間雙重突變共13例(2.36%)，其中18外顯子與19外顯子雙重突變1例(0.18%)，18外顯子與20外顯子雙重突變1例(0.18%)，19外顯子與20外顯子雙重突變7例(1.27%)，19外顯子與21外顯子雙重突變4例(0.73%)，見表2。EGFR基因各外顯子內(nèi)雙重突變共12例(2.18%)，其中18外顯子內(nèi)無雙重突變，19外顯子內(nèi)雙重突變共9例(1.64%)，20外顯子雙重突變共2例(0.36%)，21外顯子雙重突變共1例(0.18%)。見表3。

表1 550例非小細(xì)胞肺癌患者EGFR基因突變220例突變位點(diǎn)分析

表2 13例EGFR基因各外顯子間雙重突變資料

表3 12例EGFR基因各外顯子內(nèi)雙重突變資料

2.2 K-Ras基因突變和BRAF基因突變分析 550例中有11例(2.00%)檢測到K-Ras基因突變，其中10例(1.82%)檢測到第2號外顯子12密碼子突變，包含G12C點(diǎn)突變3例(0.55%)，G12D點(diǎn)突變2例(0.36%)，G12V 點(diǎn)突變 4 例(0.73%)，G12S點(diǎn)突變1例(0.18%)，未見G12A和G12R點(diǎn)突變;其中1例(0.18%)檢測到K-Ras基因13密碼子突變，為G13D點(diǎn)突變，未檢測到G13C點(diǎn)突變;本次檢測未見到K-Ras基因61密碼子Q61H、Q61L和Q61R點(diǎn)突變;BRAF基因V600E點(diǎn)突變2例，未見V600D和V600R點(diǎn)突變。

3 討論

EGFR是酪氨酸激酶I型受體家族的成員之一，它包含有一個(gè)細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)、單一的跨膜區(qū)和一個(gè)含酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)的胞內(nèi)區(qū)。EGFR與配體結(jié)合導(dǎo)致重要的構(gòu)象變化，暴露受體中的二聚環(huán)結(jié)構(gòu)，引發(fā)自身磷酸化，轉(zhuǎn)導(dǎo)下游信號，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、存活和一系列復(fù)雜的過程。NSCLC患者中EGFR基因突變主要發(fā)生在胞內(nèi)TK區(qū)域前四個(gè)(18-21)外顯子上，目前報(bào)道發(fā)現(xiàn)的TK區(qū)域突變有30多種［12］，最常見的19和21外顯子突變約占85%［13］。本研究顯示，EGFR基因的總突變率為37.09%(204/550)，明顯高于西方人群［11，14-15］。EGFR基因4個(gè)外顯子中19和21外顯子突變率為86.76%(177/204)，與以往文獻(xiàn)報(bào)道相符［13］。其中19外顯子突變占總突變56.86%(116/204)，且以缺失突變?yōu)橹?，點(diǎn)突變及插入突變少見;21外顯子突變占總突變29.90%(61/204)，且以L858R點(diǎn)突變?yōu)橹?，其他位點(diǎn)突變少見;18外顯子突變占總突變3.92%(8/204)，其中以G719X突變(G719A/S/C)點(diǎn)突變?yōu)橹?20外顯子突變占總突變9.80%(20/204)，其中以Q787Q同義點(diǎn)突變?yōu)橹鳎琓790M點(diǎn)突變占15.00%(3/20)。據(jù)以上分析得知:18、19和21外顯子累積突變率為90.20%(184/204)，提示18、19和21外顯子易受環(huán)境致癌物的攻擊，突變后可能進(jìn)一步激活EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要的作用。20外顯子突變率為9.80%(20/204)，突變后可能改變了酪氨酸激酶區(qū)ATP結(jié)合囊的構(gòu)象，從而增強(qiáng)了ATP與EGFR的親和性，使腫瘤細(xì)胞對EGFR-TKIs產(chǎn)生抵抗性，這一突變主要見于EGFR-TKIs治療后復(fù)發(fā)者［16-20］。

Ras基因家族成員包括H-Ras、N-Ras和K-Ras 3種亞型，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［21］，其中KRas基因與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系最為密切。KRas基因異常主要為點(diǎn)突變和基因擴(kuò)增，由于第4外顯子的拼接方式不同，更易發(fā)生突變［22］。K-Ras基因點(diǎn)突變以第2號外顯子11、12、13、59和61密碼子多見，其中96%發(fā)生在第2號外顯子12、13密碼子。這些密碼子編碼的氨基酸是K-Ras蛋白與GTP酶活化蛋白(GAP)作用位點(diǎn)。正常情況下，KRas蛋白通過GDP/GTP之間的轉(zhuǎn)換來實(shí)現(xiàn)下游信號通路的調(diào)控。而突變的K-Ras蛋白不依賴上級信號的刺激，處于與GTP持續(xù)結(jié)合狀態(tài)，導(dǎo)致下游的信號通路異?；钴S，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長與增殖［23］。本研究顯示，K-Ras基因的總突變率為2.00%(11/550)，與 Sun 等［24］研究(1.90%)接近。12密碼子突變占總突變的90.91%(10/11)，其中G12C點(diǎn)突變占總突變的27.27%(3/11)，G12D點(diǎn)突變占總突變的18.18%(2/11)，G12V點(diǎn)突變占總突變的 36.36%(4/11)，G12S點(diǎn)突變占總突變9.09%(1/11)，此次未見G12A和G12R點(diǎn)突變;13密碼子突變占總突變的9.09%(1/11)，為G13D點(diǎn)突變，此次未檢測到G13C點(diǎn)突變;本次檢測未見到K-Ras基因61密碼子Q61H、Q61L和Q61R點(diǎn)突變。

BRAF基因與ARAF、RAF1同屬于RAF基因家族，作為RAF-MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要成員，介導(dǎo)RAS與MAPK相結(jié)合，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡。BRAF蛋白與K-Ras蛋白同為RAFMEK-ERK信號通路中上游調(diào)節(jié)因子，在 MAPK/ERK信號通路中起著舉足輕重的作用;BRAF基因突變可通過兩種途徑致病，一是因遺傳而導(dǎo)致先天性缺陷的途徑，二是后天獲得致癌基因而導(dǎo)致腫瘤的途徑。有研究報(bào)道BRAF基因突變在NSCLC中突變率為1% ～3%［25］。本研究顯示BRAF基因的總突變率為0.36%(2/550)，低于文獻(xiàn)報(bào)道，突變類型均為V600E點(diǎn)突變，未見V600D和V600R點(diǎn)突變。

總之，NSCLC患者中EGFR基因存在較高的突變率，尤其為19和21外顯子突變，其基因突變分型能指導(dǎo)EGFR-TKI的腫瘤靶向治療，K-Ras和BRAF基因突變率雖低但不容忽視。

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