補(bǔ)骨脂單體成分對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化的影響*

柴麗娟，樊　娜，王　虹，，張　晗，王少峽，，苗　琳，毛浩萍，周　昆（.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津30093；.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津30093）

·中藥研究·

補(bǔ)骨脂單體成分對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化的影響*

柴麗娟1，樊娜1，王虹1，2，張晗1，王少峽1，2，苗琳1，毛浩萍2，周昆2
（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193）

［目的］研究補(bǔ)骨脂單體成分異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂查爾酮對(duì)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）及成熟破骨細(xì)胞形成數(shù)目、體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖與分化的影響。［方法］體外采用巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受體活化因子配體（RANKL）誘導(dǎo)培養(yǎng)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，考察異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素查爾酮對(duì)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞在分化過(guò)程中其標(biāo)志性酶TRACP的活性和成熟破骨細(xì)胞產(chǎn)生數(shù)目的影響。對(duì)硝基苯磷酸鹽法（PNPP法）測(cè)定破骨細(xì)胞TRACP活性，TRACP細(xì)胞染色法鑒定并檢測(cè)成數(shù)破骨細(xì)胞數(shù)目。酶消化法體外培養(yǎng)新生小鼠成骨細(xì)胞，（CCK-8）（cell counting kit-8）法檢測(cè)兩成分對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響，磷酸苯二鈉法測(cè)定兩成分對(duì)成骨細(xì)胞標(biāo)志性酶堿性磷酸酶（ALP）的影響。［結(jié)果］體外成功培養(yǎng)小鼠破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，兩細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)各自的標(biāo)志性酶TRACP和ALP。異補(bǔ)骨脂查爾酮在0.05 μmol/L濃度下對(duì)成熟破骨細(xì)胞的形成有顯著抑制作用。異補(bǔ)骨脂素在0.1 μmol/L濃度下對(duì)成骨細(xì)胞增殖有顯著促進(jìn)作用。［結(jié)論］補(bǔ)骨脂單體成分異補(bǔ)骨脂素對(duì)成骨細(xì)胞有促進(jìn)作用、異補(bǔ)骨脂查爾酮對(duì)破骨細(xì)胞有抑制作用，提示補(bǔ)骨脂可能作為抗骨質(zhì)疏松或骨吸收的藥物。

異補(bǔ)骨脂素；異補(bǔ)骨脂查爾酮；成骨細(xì)胞；破骨細(xì)胞；增殖；分化

骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率已躍居常見病、多發(fā)病的第7位［1］，如何預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥日益受到普遍重視。無(wú)論是I型還是II型骨質(zhì)疏松癥，都與雌激素缺乏有直接或間接關(guān)系［2-4］，臨床上應(yīng)用雌激素治療骨質(zhì)疏松癥有效但存在引起癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，利用植物雌激素防治骨質(zhì)疏松癥成為目前關(guān)注的焦點(diǎn)。

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂（PsoraleacorylifoliaL.）的干燥果實(shí)，具有溫腎助陽(yáng)、納氣止瀉的功效，臨床治療骨質(zhì)疏松癥有效［5-7］，其有效成分具有雌激素樣活性［8］，課題組前期研究也證實(shí)，補(bǔ)骨脂的活性成分具有與雌激素受體［9］、雄激素受體［10］的結(jié)合能力。補(bǔ)骨脂含有多種活性成分，體外單體成分的研究是其藥理研究的基礎(chǔ)，本研究主要探討補(bǔ)骨脂單體成分異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂查爾酮對(duì)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞的增殖與分化作用，為補(bǔ)骨脂的臨床使用及新藥研發(fā)提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料4～6周齡雌性昆明小鼠、乳鼠購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［動(dòng)物合格許可證：SCXK（軍）2009-003］，改良型α-MEM培養(yǎng)基（Hyclone），F(xiàn)BS（Invitrogen），巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）、核因子κβ受體活化因子配體（RANKL）（R&D），低糖型DMEM、Ⅱ型膠原酶、Acid Phosphatase Leukocyte（TRAP）Kit（Sigma），CCK-8（日本同仁化工），補(bǔ)骨脂素（中國(guó)食品藥品檢定研究所），補(bǔ)骨脂酚（MUST）。其它試劑均為市售分析純產(chǎn)品。多功能讀板機(jī)（Felex station 3，MD，美國(guó)）；超聲破碎儀（VCX 130，Sonics，USA），倒置熒光顯微鏡（TE300，Nikon，日本），CO2培養(yǎng)箱（Thermo，美國(guó)），酶標(biāo)儀（PE，美國(guó)）。

1.2體外破骨細(xì)胞前體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)脫臼處死4～6周雌性昆明小鼠，75%乙醇消毒后取四肢長(zhǎng)骨，去除骨表面軟組織和骨骺，置入保持低溫的α-MEM全培基（15%FBS，1%雙抗）中。用1 mL注射器吸取全培基，反復(fù)沖洗骨髓腔和骨內(nèi)表面，直至骨壁變白為止。骨髓懸液用200目細(xì)胞篩過(guò)濾，將過(guò)濾后的細(xì)胞懸液均勻接種至75 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。24 h后將未貼壁的細(xì)胞和全培基倒入50 mL離心管中離心，棄去上清液，加入一定量全培基，混勻細(xì)胞后計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至5×106個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種到相應(yīng)培養(yǎng)板，培養(yǎng)48 h后，吸去全培基去除未貼壁細(xì)胞，加入DHanks輕輕洗滌細(xì)胞兩次，加入含或不含藥物的含有刺激因子全培基。刺激因子濃度為M-CSF，10 ng/mL和RANKL，30 ng/mL。

1.3小鼠成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)取出生2～3 d的昆明小鼠15只，75%乙醇浸泡消毒，無(wú)菌條件下取顱蓋骨，去除骨膜和軟組織，0.25%的胰酶37℃氣浴消化15 min；取出骨片，將顱骨片剪成約1 mm×1 mm大小的骨片；加入0.1%Ⅱ型膠原酶37℃氣浴搖床中振蕩消化90 min；吸取上清液，丟棄骨片；放入另一個(gè)50 mL離心管中離心收集細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基（低糖型DMEM，F(xiàn)BS 15%，雙抗1%）重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移入75 cm2培養(yǎng)瓶中。顯微鏡下可以看到許多圓形的細(xì)胞。37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，每3天換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后傳代備用。改良Gomori法鑒定成骨細(xì)胞。

1.4異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂查爾酮對(duì)破骨細(xì)胞TRACP表達(dá)的影響將原代取材破骨細(xì)胞前體細(xì)胞經(jīng)過(guò)48 h貼壁洗滌后，加入含或不含RANKL和M-CSF的α-MEM全培基進(jìn)行刺激。刺激同時(shí)加入異補(bǔ)骨脂素或異補(bǔ)骨脂查爾酮進(jìn)行藥效研究，培養(yǎng)7 d后對(duì)硝基苯磷酸鹽法（PNPP）法檢測(cè)破骨細(xì)胞抗抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）活性。細(xì)胞加藥分組如下：1）對(duì)照組：正常培養(yǎng)基；2）模型組：含M-CSF 10 ng/mL，RANKL 30 ng/mL的全培基（M10R30）；3）異補(bǔ)骨脂素高中低劑量組：在模型組基礎(chǔ)上含有0.05、0.1、0.5 μmol/L的異補(bǔ)骨脂素；4）異補(bǔ)骨脂查爾酮高中低劑量組：在模型組基礎(chǔ)上含有0.05、0.1、0.5μmol/L的異補(bǔ)骨脂查爾酮。

PNPP法檢測(cè)小鼠破骨細(xì)胞TRACP酶活性：吸除需檢測(cè)96孔板細(xì)胞培養(yǎng)上清液，加入D-Hanks液清洗細(xì)胞2次，加入0.1%Triton X-100裂解10 min，加入PNPP反應(yīng)液（PNPP 2 g/L，L-酒石酸鈉7.6 g/L）100 μL在37℃下孵育30 min，加入100 μL 1 mol/L的NaOH終止。405 nm多功能讀板機(jī)上讀值。

1.5補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚對(duì)TRACP陽(yáng)性多核成熟破骨細(xì)胞形成數(shù)目的影響將原代取材破骨細(xì)胞前體細(xì)胞經(jīng)過(guò)48 h貼壁洗滌后，加入含或不含RANKL和M-CSF的α-MEM全培基進(jìn)行刺激。刺激同時(shí)加入異補(bǔ)骨脂素或異補(bǔ)骨脂查爾酮進(jìn)行藥效研究，培養(yǎng)14 d后進(jìn)行破骨細(xì)胞染色計(jì)數(shù)。倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)TRACP陽(yáng)性并且核≥3個(gè)的視為成熟破骨細(xì)胞。分組同上。破骨細(xì)胞染色根據(jù)Acid Phosphatase Leukocyte（TRAP）Kit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚對(duì)體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞增殖的影響待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后傳代，種入96孔板中，2×104個(gè)/mL種入，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%融合時(shí)，加入含異補(bǔ)骨脂素或異補(bǔ)骨脂查爾酮的全培基（含2% FBS），培養(yǎng)7 d后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。細(xì)胞加藥分組如下：1）對(duì)照組：正常培養(yǎng)基；2）異補(bǔ)骨脂素高中低劑量組：0.05、0.1、0.5 μmol/L；3）異補(bǔ)骨脂查爾酮高中低劑量組：0.05、0.1、0.5 μmol/L。

1.7補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚對(duì)體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞ALP表達(dá)的影響細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后傳代，種入96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)，加入含異補(bǔ)骨脂素或異補(bǔ)骨脂查爾酮的全培基（含2%FBS），培養(yǎng)7 d后，磷酸苯二鈉比色法測(cè)定成骨細(xì)胞ALP的表達(dá)情況。細(xì)胞加藥分組同上。

成骨細(xì)胞ALP測(cè)定：磷酸苯二鈉法測(cè)定成骨細(xì)胞ALP酶的表達(dá)情況，510 nm讀取吸光度。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。正態(tài)分布計(jì)量資料的組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較時(shí)，若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)，偏態(tài)分布計(jì)量資料的組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞培養(yǎng)鑒定顯微鏡下觀察誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d的破骨細(xì)胞，細(xì)胞邊緣不規(guī)則，有突起和偽足，胞漿可見大小不等的空泡，呈現(xiàn)吞噬樣細(xì)胞形態(tài)，體積大，直徑約100 μm，含有2～50個(gè)緊密堆積的核。TRACP高表達(dá)是破骨細(xì)胞主要標(biāo)志性酶，研究所培養(yǎng)破骨細(xì)胞經(jīng)TRACP染色后，可見大量多核細(xì)胞，胞漿呈現(xiàn)出均勻分布的紫紅色或棕紅色顆粒，部分胞漿內(nèi)可見大小不一的空泡，說(shuō)明本研究培養(yǎng)的破骨細(xì)胞TRACP表達(dá)強(qiáng)，具有破骨細(xì)胞的主要生物學(xué)特征。見如圖1。

原代培養(yǎng)成骨細(xì)胞呈圓球狀，透明，分散存在，大小均一。培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞已完全貼壁展開。展開后的細(xì)胞形態(tài)多不規(guī)則，呈三角形、多角形，有較多突起，胞漿豐富、清晰。生長(zhǎng)期細(xì)胞分裂多見，細(xì)胞多突起互相連接。匯合時(shí)細(xì)胞呈鋪路石狀，并可重疊生長(zhǎng)（如圖1）。在pH9.4條件下，成骨細(xì)胞標(biāo)志酶ALP使孵育液中β-甘油磷酸鈉水解產(chǎn)生磷酸根，經(jīng)過(guò)一些列反應(yīng)最后生成CoS棕黑色沉淀。研究所培養(yǎng)成骨細(xì)胞經(jīng)胞質(zhì)呈灰黑色、深黑顆?；蚱瑺畛恋?，說(shuō)明原代培養(yǎng)成骨細(xì)胞ALP含量高，具有成骨細(xì)胞的主要生物學(xué)特征。

圖1　小鼠破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定Fig.1　Primary culture and identification of mouse osteoclast and osteoblast

2.2異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂查爾酮對(duì)破骨細(xì)胞TRACP酶活性的影響M-CSF和RANKL可以顯著誘導(dǎo)破骨細(xì)胞TRACP酶的表達(dá)，異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂查爾酮有降低其表達(dá)的趨勢(shì)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1。

表1　異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂查爾酮對(duì)M10R30誘導(dǎo)下破骨細(xì)胞TRACP表達(dá)的影響（±s）Tab.1　The expression of TRACP in osteoclasts induced by M10R30 treated by isopsoralen or isobavachalcone（±s）%

表1　異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂查爾酮對(duì)M10R30誘導(dǎo)下破骨細(xì)胞TRACP表達(dá)的影響（±s）Tab.1　The expression of TRACP in osteoclasts induced by M10R30 treated by isopsoralen or isobavachalcone（±s）%

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別n異補(bǔ)骨脂素異補(bǔ)骨脂查爾酮TRACP（占對(duì)照組比例）TRACP（占對(duì)照組比例）對(duì)照組241.00±0.341.00±0.34模型組242.33±0.54*2.33±0.54*低劑量組121.94±0.622.06±0.47中劑量組121.88±0.612.07±0.54高劑量組121.96±0.822.20±0.55

2.3異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂查爾酮對(duì)成熟破骨細(xì)胞形成數(shù)目的影響模型組在M10R30誘導(dǎo)下可以提高成熟破骨細(xì)胞的形成數(shù)目，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。異補(bǔ)骨脂素在不同濃度下對(duì)成熟破骨細(xì)胞形成的沒有影響；異補(bǔ)骨脂查爾酮在0.05、0.1、0.5 μM濃度下有降低破骨細(xì)胞形成的趨勢(shì)，以低亮劑量0.05μmol/L濃度下作用顯著。見表2。

表2　異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂查爾酮對(duì)M10R30誘導(dǎo)下成熟破骨細(xì)胞形成數(shù)目的影響（±s）Tab.2　The number of mature osteoclasts induced by M10R30 treated by isopsoralen or isobavachalcone（±s）個(gè)

表2　異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂查爾酮對(duì)M10R30誘導(dǎo)下成熟破骨細(xì)胞形成數(shù)目的影響（±s）Tab.2　The number of mature osteoclasts induced by M10R30 treated by isopsoralen or isobavachalcone（±s）個(gè)

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

TRACP陽(yáng)性且胞核≥3的細(xì)胞數(shù)對(duì)照組600.9±01.400.9±01.4模型組642.9±30.6*42.9±20.0*低劑量組942.8±19.316.5±08.3#中劑量組941.0±16.229.3±10.5高劑量組939.0±14.030.5±11.7組別n異補(bǔ)骨脂素異補(bǔ)骨脂查爾酮TRACP陽(yáng)性且胞核≥3的細(xì)胞數(shù)

2.4異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂查爾酮對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化的影響成骨細(xì)胞增殖期，成骨細(xì)胞數(shù)目顯著增加形成多層細(xì)胞，并合成、分泌Ⅰ型膠原以便最終可以礦化形成骨結(jié)節(jié)。從表3可以看出，異補(bǔ)骨脂素0.1 μmol/L中濃度劑量下對(duì)體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞增殖有顯著促進(jìn)作用（P＜0.05），異補(bǔ)骨脂查爾酮無(wú)此作用。ALP是成骨細(xì)胞合成分泌的標(biāo)志性功能酶，分解有機(jī)鹽、誘導(dǎo)鈣鹽沉積，促進(jìn)類骨質(zhì)礦化。兩成分對(duì)體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞ALP的表達(dá)沒有影響。見表3。

表3　異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂查爾酮對(duì)成骨細(xì)胞增殖與分化的影響（±s）Tab.3　The proliferation and differentiation in mouse osteoblast treated by isopsoralen or isobavachalcone（±s）%

表3　異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂查爾酮對(duì)成骨細(xì)胞增殖與分化的影響（±s）Tab.3　The proliferation and differentiation in mouse osteoblast treated by isopsoralen or isobavachalcone（±s）%

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

異補(bǔ)骨脂素異補(bǔ)骨脂查爾酮（占對(duì)照組比例）（占對(duì)照組比例）增殖分化增殖分化對(duì)照組91.00±0.301.00±0.101.00±0.301.00±0.10低劑量組60.98±0.100.94±0.201.02±0.100.93±0.20中劑量組61.39±0.60*0.88±0.100.98±0.200.82±0.20高劑量組61.03±0.201.06±0.400.97±0.200.94±0.20組別n

3　討論

破骨細(xì)胞是骨質(zhì)疏松過(guò)程中行使骨吸收的主要功能細(xì)胞，但其培養(yǎng)及純化難度較大，且為終末分化細(xì)胞，不能傳代，因此破骨細(xì)胞大量培養(yǎng)仍難以實(shí)現(xiàn)。其主要來(lái)源于單核-巨噬細(xì)胞系前體細(xì)胞，破骨細(xì)胞前體細(xì)胞在骨營(yíng)養(yǎng)激素和骨微環(huán)境因子調(diào)節(jié)下，由多個(gè)單核細(xì)胞融合變成多核巨細(xì)胞，含有2～50個(gè)緊密堆積的核，直徑約100 μm左右。體外破骨細(xì)胞培養(yǎng)方法較多，如機(jī)械分離法、骨髓誘導(dǎo)培養(yǎng)法、脾干細(xì)胞誘導(dǎo)法、RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)法、外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)法等。研究選用骨髓誘導(dǎo)培養(yǎng)法可使單核細(xì)胞定向分化為破骨細(xì)胞，獲得較多的破骨細(xì)胞，是實(shí)驗(yàn)室較為理想的體外破骨細(xì)胞培養(yǎng)方法。

現(xiàn)普遍接受的觀點(diǎn)是：破骨細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞共同來(lái)源于同一造血干細(xì)胞。巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）促進(jìn)造血干細(xì)胞分化為單核巨噬細(xì)胞克隆形成單位（CFU-M），并維持其增殖和分化能力。這些單核前體細(xì)胞移位至骨吸收區(qū)域，在M-CSF持續(xù)作用下分化為破骨細(xì)胞前體，隨后在M-CSF和RANKL等因子協(xié)同作用下，融合為多核破骨細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞開始呈現(xiàn)TRACP陽(yáng)性，直至破骨細(xì)胞成熟，只有成熟的破骨細(xì)胞才具有骨吸收能力。M-CSF和RANKL是破骨細(xì)胞分化與活化所必須的兩種因子。多核破骨細(xì)胞經(jīng)RANKL和其它因子刺激活化，發(fā)揮骨吸收功能。TRACP及骨吸收活性等指標(biāo)常被用來(lái)辨別破骨細(xì)胞分化過(guò)程中所處階段。成熟破骨細(xì)胞內(nèi)含有大量TRACP酶，破骨細(xì)胞行使骨吸收時(shí)，TRACP由破骨細(xì)胞內(nèi)溶酶體樣結(jié)構(gòu)中分泌至骨吸收表面，將骨橋蛋白以及骨連素等非膠原骨基質(zhì)蛋白去磷酸化，從而有利于破骨細(xì)胞與骨吸收處表面的黏接，它是破骨細(xì)胞的一種標(biāo)志酶。

研究認(rèn)為成熟的破骨細(xì)胞具有3個(gè)核以上，并且TRACP強(qiáng)表達(dá)。破骨細(xì)胞TRACP活性檢測(cè)表明，異補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂查爾酮對(duì)分化過(guò)程中破骨細(xì)胞標(biāo)志酶TRACP酶沒有影響，但異補(bǔ)骨脂查爾酮在不同濃度下有降低成熟破骨細(xì)胞形成數(shù)目的趨勢(shì)，尤其在0.05 μmol/L濃度下可以顯著降低破骨細(xì)胞的形成。這與Park CK等［11］的研究相吻合之處，他們也報(bào)道補(bǔ)骨脂查爾酮（Bavachalcone）通過(guò)對(duì)ERK、Akt、c-Fos和NFATc1干預(yù)抑制破骨細(xì)胞形成，認(rèn)為補(bǔ)骨脂查爾酮可以作為治療關(guān)于骨吸收疾病的藥物。

成骨細(xì)胞的來(lái)源主要有骨（新生動(dòng)物或胚胎動(dòng)物顱骨）、骨膜和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，成骨細(xì)胞骨形成過(guò)程中經(jīng)過(guò)增殖、分化、礦化和凋亡4個(gè)階段，一般認(rèn)為，ALP是成骨細(xì)胞分化的代表性酶，在體外鈣化中起關(guān)鍵性作用。本研究培養(yǎng)的成骨細(xì)胞ALP染色呈陽(yáng)性，證明研究采用的成骨細(xì)胞具有強(qiáng)的分泌ALP的能力，符合成骨細(xì)胞的生物學(xué)特征。

關(guān)于補(bǔ)骨脂對(duì)體外成骨細(xì)胞作用研究的較多，如補(bǔ)骨脂水提液、醇提液、補(bǔ)骨脂有效成分對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、分化、成骨細(xì)胞骨生成的相關(guān)指標(biāo)如膠原酶的合成、骨保護(hù)素（OPG）分泌、骨鈣素分泌，增加鈣化結(jié)節(jié)等各項(xiàng)研究都已開展很多。如異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖［12］，補(bǔ)骨脂素10 μmol/L能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖［13-14］，與他們的研究相類似，本研究也發(fā)現(xiàn)異補(bǔ)骨脂素在0.1 μmol/L濃度時(shí)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。兩者對(duì)成骨細(xì)胞ALP表達(dá)沒有促進(jìn)作用。

中藥成分復(fù)雜，中藥有效單體成分的藥理機(jī)制是中藥藥理研究的前提。本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂的單體成分異補(bǔ)骨脂查爾酮能抑制破骨細(xì)胞的形成，異補(bǔ)骨脂素能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。提示補(bǔ)骨脂的有效單體成分可能協(xié)同起效，有的成分促進(jìn)成骨細(xì)胞功能，有的成分抑制破骨細(xì)胞功能，糾正骨質(zhì)疏松過(guò)程中破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞之間的失衡，說(shuō)明補(bǔ)骨脂具有進(jìn)一步研發(fā)成抗骨質(zhì)疏松或骨吸收新藥的前景。

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（本文編輯：高杉，張震之）

The effects of psoralen components on mice osteoblast and osteoclast differention in vitro

CHAI Li-juan1，F(xiàn)AN Na1，WANG Hong1，2，ZHANG Han1，WANG Shao-xia1，2，MIAO Lin1，MAO Hao-ping2，ZHOU Kun2
（1．Tianjin Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tianjin Key Laboratory of Chinese Medical Pharmacology，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To study the effects of psoralen components，isopsoralen and isobavachalcone on the cultured osteoclasts TRACP enzyme activity and differention.Moreover，the effect of two components on the mice osteoblasts proliferation and differentiation were also studied.［Methods］Using M-CSF and RANKL，osteoclast precursor cells were induced to differentiated into mature osteoclasts.During the differention period，isopsoralen and isobavachalcone were added to cells，therefore PNPP were used to detected osteoclasts TRACP activity.ICC staining of TRACP were performed to identify mature osteoclasts number.The neonatal mice osetoblast cells were cultured in vitro，CCK-8 methods were adopted to detected the osteoblast proliferation properties.Sodium phenylphosphate were used to measure the osteoblast marker enzyme ALP activity.［Results］Mouse osteoclasts and osteoblasts were cultured successfully in vitro.Isobavachalcone significantly inhibit the mature osteoclast formation at the dose of 0.05 μM，and isopsoralen had a significant role in promoting osteoblast proliferation at the dose of 0.1 μM.［Conclusion］Psoralea components isopsoralen and isobavachalcone have effects on bone cells，suggesting that Fructus Psoraleae maybe act as a drug for anti-osteoporosis or anti-bone resorption.

isopsoralen；isobavachalcone；osteoclasts；osteoblast；proliferation；differention

R285.5

A

1672-1519（2015）05-0299-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.05.12

國(guó)家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（81102860，81202991）。

柴麗娟（1976-），女，博士研究生，助理研究員，主要從事中藥雌激素樣活性防治骨質(zhì)疏松研究。

（2014-11-29）