丹參酮Ⅰ脂質(zhì)體的制備及表征*

郭麗麗，范麗麗，王愛潮，龐曉晨，羅　配，楊紅云，王少峽，劉志東（1.天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津中醫(yī)藥大學，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程研究中心，天津300193；3.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室——省部共建國家重點實驗室，天津市中藥藥理學重點實驗室，天津300193）

丹參酮Ⅰ脂質(zhì)體的制備及表征*

郭麗麗1，2，范麗麗1，2，王愛潮1，2，龐曉晨1，2，羅配1，2，楊紅云1，3，王少峽1，3，劉志東1，2
（1.天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津中醫(yī)藥大學，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程研究中心，天津300193；3.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室——省部共建國家重點實驗室，天津市中藥藥理學重點實驗室，天津300193）

［目的］制備丹參酮Ⅰ脂質(zhì)體，并對其包封率、粒徑、電位等理化性質(zhì)進行考察。［方法］采用薄膜分散法丹參酮Ⅰ脂質(zhì)體，用瓊脂糖凝膠柱色譜法和紫外分光光度法測定包封率，用差示掃描量熱法檢測丹參酮Ⅰ脂質(zhì)體各組成物質(zhì)的相變過程。［結(jié)果］丹參酮Ⅰ在1.004～6.024 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9），瓊脂糖凝膠柱色譜法能有效分離脂質(zhì)體和游離藥物，加樣回收率為（98.23±0.02）%，平均包封率為（92.56±0.39）%，粒徑為（90.64±1.21）nm，電位為（-35.37±0.84）mV。［結(jié)論］薄膜分散法可用于制備丹參酮Ⅰ脂質(zhì)體，制備的丹參酮Ⅰ脂質(zhì)體的包封率高，粒徑均一，電位穩(wěn)定，藥物含量和包封率測定方法準確可靠，專屬性強。

丹參酮Ⅰ；脂質(zhì)體；包封率

丹參酮Ⅰ（TSⅠ）是中藥丹參中的脂溶性有效成分，不僅具有天然抗氧化性、心血管藥理作用以及抗菌消炎作用，還具有明顯的抗腫瘤作用［1］，能抑制人肝癌細胞（HepG2）、人肺腺癌細胞（CL1-5）生長［2-3］，另有文獻報道丹參酮Ⅰ有提高小鼠學習記憶能力的作用［4］。丹參酮Ⅰ在水中溶解度低，有研究者曾將丹參酮Ⅰ制備成鹽或固體分散物，動物實驗表明，丹參酮Ⅰ固體給藥時吸收效果差［5］。為了使其更好地發(fā)揮療效、提高其生物利用度，結(jié)合脂質(zhì)體能增加脂溶性藥物溶解度的特性，擬通過將丹參酮Ⅰ包封成脂質(zhì)體。因此本研究采用薄膜分散法制備了丹參酮Ⅰ脂質(zhì)體（TSⅠ-LP），用瓊脂糖凝膠柱色譜法測定包封率，為該制劑的優(yōu)化與評價提供了可靠保證。

1　儀器與試劑

1.1儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；紫外分光光度計（WFZ-2800H，尤尼柯上海儀器有限公司）；LF-50脂質(zhì)體擠出儀（Avestin，加拿大）；超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；C3860A超聲清洗器（天津Autoscience公司）；AX205電子天平（Mettler toledo，瑞士）；BP121S電子天平（德國Sartorius公司）；DELTTA320 PH計（Mettler toledo，瑞士）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore，美國）；激光粒徑測定儀（馬爾文Nano ZS，英國）；Jade DSC差示掃描量熱儀（Perkin-Elmer，美國）；冷凍干燥器（ELEYA FDU-2100，日本）

1.2試劑蛋黃卵磷脂（上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，批號DE-13022，質(zhì)量分數(shù)80%）；丹參酮Ⅰ標準品（天津中新藥業(yè)集團股份有限公司提供，批號W13-0-1，質(zhì)量分數(shù)≥98%）；膽固醇（鄭州利偉生物實業(yè)有限公司，批號120712-16）；瓊脂糖凝膠（Sepharose CL-4B，批號17-0150-01，美國，粒徑45～165 μm，分離范圍70×103～20×108）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1丹參酮Ⅰ脂質(zhì)體的制備精密稱取處方量的蛋黃卵磷脂:膽固醇:TSⅠ（20∶5∶1，質(zhì)量比）共溶于適量無水乙醇中。超聲溶解后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上以50 r/min、40℃減壓除去乙醇。形成薄膜后，加入一定量的去離子水洗脫薄膜，充分水化，冰水浴探頭超聲120次后（200 w，每次3 s，間歇3 s），經(jīng)脂質(zhì)體擠出儀過0.40 μm和0.20 μm濾膜，即得丹參酮Ⅰ脂質(zhì)體。

2.2檢測波長以甲醇作為空白，通過對TSⅠ對照品溶液、空白脂質(zhì)體進行紫外掃描，可見空白脂質(zhì)體對藥物的檢測無干擾，在244 nm處有最大吸收，故選擇244 nm作為檢測波長。

2.3標準曲線的繪制精密稱取TSⅠ對照品適量于容量瓶中，加甲醇溶解制備成100.40 μg/mL的標準液，用甲醇稀釋適當倍數(shù)分別配制成濃1.004、2.008、4.016、5.020和6.024 μg/mL的TSⅠ系列標準品溶液，以甲醇為空白，在244 nm處測定吸光度。以吸光度A（Abs）對濃度C（μg/mL）作圖并進行線性回歸，得回歸方程：C=0.131 8A+0.005 9，r= 0.999 9，在1.004～6.024 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好［6-8］。

2.4精密度精密量取TSⅠ對照品儲備液適量，配制成1.004、4.016、6.024 μg/mL溶液，分別每日重復測定5次，連續(xù)測定3 d，記錄TSⅠ的吸光度值，計算日內(nèi)、日間RSD值分別為0.19%、0.13%，表明儀器精密度良好。

2.5包封率的測定

2.5.1瓊脂糖膠柱色譜條件于10 mL注射器針筒底部墊上兩層脫脂棉。將溶脹12 h以上的8 mL液態(tài)瓊脂糖凝膠（Sepharose CL-4B）裝填于針筒內(nèi)，用20%乙醇、洗脫液PBS（pH6.8）依次沖洗柱子（4～5個柱體積），再用空白脂質(zhì)體（2～3個柱體積）沖洗柱子至平衡后，加入TSⅠ-LP混懸液0.5 mL，用PBS（pH6.8）洗脫，流速1.0 mL/min，室溫條件下進行［9］。

2.5.2洗脫曲線的繪制用PBS（pH6.8）洗脫，分段收集，每份1 mL，接取20份，用甲醇分別稀釋不同倍數(shù)，用紫外分光光度計于244 nm處測定樣品的吸光度，根據(jù)2.3項下標準曲線計算濃度，用濃度C（μg/mL）為縱坐標，洗脫體積為橫坐標，繪制洗脫曲線，見圖1。根據(jù)圖1，前11 mL洗脫下來的為TSⅠ-LP，游離藥物從15 mL開始流出，到19 mL洗脫完全，此洗脫條件能很好地分離脂質(zhì)體和藥物。

圖1　TSⅠ-LP在瓊脂糖膠柱上的洗脫曲線Fig.1　Elution curve of TSⅠ-LP on Sepharose gel

2.5.3加樣回收率配制高、中、低3種濃度的TSⅠ的2%Tween-80溶液，精密量取0.5 mL，分別與0.5 mL空白脂質(zhì)體混合后上樣，按2.5.1項下條件洗脫，收集游離藥物組分后，用甲醇分別稀釋，用紫外分光光度計于244 nm處測定樣品的吸光度，根據(jù)2.3項下標準曲線計算濃度和回收率。結(jié)果高、中、低不同濃度的樣品回收率分別為100.00%、98.41%、96.28%，平均回收率為（98.23±0.02）%，表明該方法和條件可用于TSⅠ-LP洗脫。

2.5.4TSⅠ-LP包封率測定精密吸取樣品0.5 mL，按2.6.1項下條件洗脫，收集前11 mL洗脫液，測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算TSⅠ含量（W1）。另取同一份樣品0.5 mL，用甲醇破乳稀釋至10 mL容量瓶中，測定吸光度，計算TSⅠ含量（W2）。包封率%=經(jīng)柱分離的脂質(zhì)體中含藥量（W1）/總藥量（W2）×100%。由上述公式計算得［10］，包封率為（92.56±0.39）%。

2.6粒徑和Zeta電位測定將所制得的TSⅠ-LP樣品用去離子水適當稀釋，置Nano ZS激光粒徑測定儀的石英測量池和毛細管小池中，分別測定其粒徑和Zeta電位，每份樣品各測3次。結(jié)果平均粒徑為（92.43±0.19）nm，Zeta電位為（-35.37±0.84）mV，見圖2。

圖2　TSⅠ-LP的粒徑分布和電位分布曲線Fig.2　Size and Zeta distribution curve of TSⅠ-LP

2.7差示掃描量熱法檢測將TSⅠ-LP處方中的各組分（蛋黃卵磷脂、膽固醇、TSⅠ）、凍干處理的空白脂質(zhì)體和TSⅠ-LP等樣品分別置于坩堝中，在氮氣流（20 mL/min）、加熱速度10℃/min的條件下，溫度范圍為30～400℃，測定各樣品的DSC曲線。結(jié)果可見，空白脂質(zhì)體的DSC曲線與蛋黃卵磷脂、膽固醇的DSC曲線相比，相變峰明顯不同，表明在脂質(zhì)體形成雙層膜時，脂質(zhì)體中各成分發(fā)生了一定程度的相互作用。與TSⅠ、物理混合物的DSC曲線相比，TSⅠ-LP的DSC曲線中TSⅠ的相轉(zhuǎn)變峰消失，表明TSⅠ已包裹于脂質(zhì)體中［11-13］。見圖3。

圖3　各種樣品的DSC曲線Fig.3　DSC crurves of all kinds of samples

3　討論

丹參酮Ⅰ是丹參的有效生物活性成分之一，有多項研究表明丹參酮Ⅰ具有防止肝細胞損傷和增強學習記憶的藥理作用，還可以誘導肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、血癌等癌細胞的凋亡。丹參中的二萜類化合物丹參酮主要包括丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮和二氫丹參酮，對癌癥如結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌和口腔癌等有毒性作用。目前見諸報道的主要是丹參酮ⅡA的抗癌作用，但有文獻表明在前列腺癌和卵巢癌中，丹參酮Ⅰ抑制癌細胞生長和誘導癌細胞凋亡的作用明顯強于丹參酮ⅡA，因此對適合丹參酮Ⅰ的劑型進行深入的研究，對開發(fā)其更多的藥理活性和作用機制具有重要意義［14-17］。

常用的脂質(zhì)體制備方法有薄膜分散法、逆向蒸發(fā)法、乙醇/乙醚注入法、乳化法及硫酸銨梯度法等［18］，本研究采用薄膜分散法制備丹參酮Ⅰ脂質(zhì)體，并使用探頭超聲減小其粒徑，方法簡單，重現(xiàn)性好。

在制備TSⅠ-LP時，前期采用了高壓均質(zhì)、高壓微射流、脂質(zhì)體擠出儀對脂質(zhì)體混懸液進行進一步的混勻成型，結(jié)果表明三種方法對TSⅠ-LP的載藥量影響無顯著差別，但制劑經(jīng)脂質(zhì)體擠出儀擠出后，粒徑相對更小、分布更均勻、穩(wěn)定性更高。因此，采用此法對TSⅠ-LP進行整粒。

包封率是評價脂質(zhì)體制劑質(zhì)量的重要指標，測定方法有很多種，常用的有凝膠柱層析法、透析法、微柱離心法、超速離心法、超濾離心法等［19-22］。實驗前期測定包封率考察了超速離心法、超濾離心法和瓊脂糖凝膠柱色譜法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超速離心法無法實現(xiàn)藥物與脂質(zhì)體的分離，超濾離心管對藥物存在比較嚴重的吸附作用，因而本研究最終采用了瓊脂糖凝膠柱色譜法來測定包封率。采用此法操作的缺點是：①人工填柱時，不能保證每次柱高都一致，這樣可能會產(chǎn)生測量誤差；②該法同其他方法相比，洗脫體積大、操作較繁瑣、操作時間較長。在進行洗脫條件摸索時，發(fā)現(xiàn)洗脫過程中瓊脂糖凝膠對TSⅠ-LP存在一定的吸附作用，后采用空白脂質(zhì)體預先對柱子進行沖洗至飽和，這一問題才得到解決。因此，脂質(zhì)體包封率的測定還需摸索更完善的方法進行，應結(jié)合脂質(zhì)體的性質(zhì)，選擇合適高效的測定方法。

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（本文編輯：高杉，張震之）

Preparation and characterization of TanshinoneⅠ-loaded Liposomes

GUO Li-li1，2，F(xiàn)AN Li-li1，2，WANG Ai-chao1，2，PANG Xiao-chen1，2，LUO Pei1，2，YANG Hong-yun1，3，WANG Shao-xia1，3，LIU Zhi-dong1，2
（1.Engineering Research Center of Modern Chinese Medicine Discovery and Preparation Technique，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；3.Insitute of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To prepare TanshinoneⅠ-loaded Liposomes（TSⅠ-LP）and investigate its entrapment efficiency（EE），particle size，Zeta potential and other physicochemical properties.［Methods］TSⅠ-LP were prepared by film dispersion method，and using Sepharose gel and UV spectrophotometry to determine the entrapment efficiency of TSⅠ-LP.Differential scanning calorimetry（DSC）thermograms of the liposomal samples were recorded respectively.［Results］A good linear relationship was showed of TSⅠin the range of 1.004～6.024 μg/mL（r=0.999 9）.Sepharose gel was well in separating the liposomes from free TSⅠ.The average recovery rate was（98.23±0.02）%.The EE of TSⅠ-LP was（92.56±0.39）%.The particle size was（90.64±1.21）nm and the Zeta potential was（-35.37± 0.84）mV.［Conclusion］The film dispersion method can be used to prepare TSⅠ-LP with a high EE，a narrow size distribution and a stationary potential.The method which determine the content of TSⅠ-LP is reliable and sensitive.

TanshinoneⅠ；Liposomes；entrapment efficiency

R284.2

A

1672-1519（2015）05-0308-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.05.14

教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃（NCET-12-1068）。

郭麗麗（1988-），女，碩士研究生，主要從事緩控釋制劑研究。

劉志東，E-mail:lonerliuzd@163.com。

（2015-01-23）