苦碟子注射液中4種氨基酸含量的測定*

孫　璐，劉　睿，趙　雯，李遇伯，張艷軍

苦碟子注射液中4種氨基酸含量的測定*

孫璐，劉睿，趙雯，李遇伯，張艷軍

（天津中醫(yī)藥大學，天津300193）

［目的］建立同時測定苦碟子注射液中4種氨基酸類成分（纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸）含量的2，4-二硝基氟苯（DNFB）柱前衍生化法。［方法］采用DiamonsilC18（2）色譜柱（200mm×4.6mm，5μm）；流動相A為超純水，B為pH=6.40的30mmol/L乙酸鈉（含1%N，N-二甲基甲酰胺），C為乙腈，梯度洗脫。流速為1.0m L/min，柱溫25℃，檢測波長為350 nm。［結果］對10批苦碟子注射液中4種氨基酸含量進行了測定，纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸分別在0.138 8～4.440、0.124 4～3.980、0.135 0～4.320、0.131 9～4.220mg/L范圍內(nèi)線性關系良好（r≥0.999 4）。平均回收率分別為98.49%、100.60%、98.50%、98.56%，相對標準偏差（RSD）≤2.0%（n=6）。［結論］該方法簡便、準確，可靠，為苦碟子注射液質(zhì)量控制提供參考。

苦碟子注射液；柱前衍生化；2，4-二硝基氟苯；氨基酸；高效液相色譜法

苦碟子注射液是以抱莖苦荬菜［Ixeris sonchifolia（Bge．）Hance］為原料制成的中藥注射劑，具有抗腫瘤、擴冠及改善心肌缺血等功能［1］，在腦梗死、冠心病等治療方面有重要價值［2-3］?？嗟幼⑸湟旱闹饕煞譃榘被犷惡忘S酮類［4］，早期研究認為這兩種成分具有抗腫瘤作用［5-6］。常用的氨基酸含量測定方法有自動分析儀法、高效液相色譜法、毛細管電泳法等［7］。其中自動分析儀法儀器價格昂貴，毛細管電泳法方法復雜，因此筆者采用柱前衍生化法，建立了同時測定苦碟子注射液中4種氨基酸的分析方法，并對10批注射液中的氨基酸進行了含量測定，為實際生產(chǎn)中的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1　儀器和材料

Waters-e2695高效液相色譜系統(tǒng)（含四元泵，在線真空脫氣機，自動進樣器，柱溫箱，2998光電二極管陣列檢測器，Empower 2色譜工作站，美國Waters公司），BT125D型分析天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］，THZ-82型水浴恒溫振蕩器（金壇市榮華儀器制造有限公司），KH 2200B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：140624-200805，所有對照品純度經(jīng)高效液相色譜峰面積歸一化法計算均大于99%）。乙腈（色譜純，SIGMA公司），2，4-二硝基氟苯、N，N-二甲基甲酰胺（天津一方科技有限公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。

苦碟子注射液（吉林通化華夏藥業(yè)有限公司，批號：120625、110601、120312、120109、111105、120438、111011、120209、111218、120532）。

2　方法與結果

2.1混合對照品溶液的配制精密稱取纈氨酸標準品4.44mg，異亮氨酸標準品3.98mg，亮氨酸標準品4.32mg，苯丙氨酸標準品4.22mg，分別置10mL量瓶中，先加少量80%（V/V）乙醇溶解再定容至刻度，搖勻，即得對照品儲備液。分別精密吸取對照品儲備液適量，制成含纈氨酸44.40mg/L、異亮氨酸39.80mg/L、亮氨酸43.20mg/L、苯丙氨酸42.20mg/L的混合對照品溶液。

2.2供試品溶液的配制精密量取樣品1.00 mL置10mL量瓶中，加5%碳酸氫鈉溶液1.00mL與1%2，4-二硝基氟苯乙腈溶液1.00mL，搖勻，60℃水浴中暗處加熱30 min后取出。用0.01 mol/L KH2PO4溶液定容至10mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3色譜條件Diamonsil C18（2）色譜柱（200mm× 4.6mm，5μm），柱溫：25℃；檢測波長：350 nm，流速：1.0mL/min，進樣量：10μL。流動相A：水；流動相B：30mmol/L乙酸鈉（含1%N，N-二甲基甲酰胺），pH 6.40；流動相C：乙腈；按“表1”進行梯度洗脫。

表1 流動相梯度Tab.1　Gradient of them obile phase

2.4專屬性實驗及系統(tǒng)適用性實驗在2.3項色譜條件下，空白溶液，纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸在混合對照品溶液及苦碟子注射液供試品溶液中的高效液相色譜（HPLC）圖中4種氨基酸分離效果良好。見圖1。

圖1　空白溶液、混合對照品溶液和供試品溶液的HPLC色譜圖Fig.1　Chromatogramsof blank solution，m ixed standard am ino acidssolution and sam ple solution

2.5線性關系考察精密吸取2.1項下混合對照品溶液1.00mL，加入80%（V/V）乙醇溶液1.00mL，搖勻，再精密量取該稀釋溶液1.00mL，按上述步驟逐級稀釋，即得混合對照品的系列對照溶液。將溶液按2.2項下供試品的制備方法進行衍生，然后將溶液按2.3項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖和峰面積。分別以峰面積（Y?）為縱坐標，對照品濃度（X）為橫坐標，進行線性回歸，得出各個氨基酸的回歸方程及相關系數(shù)。見表2。

表2　4種氨基酸的回歸方程、相關系數(shù)及線性范圍Tab.2　Regression equations，correlation coefficien tsand linear rangesof four am ino acids

2.6精密度實驗按2.1項下方法制備含纈氨酸8.880mg/L、異亮氨酸7.960mg/L、亮氨酸8.640mg/L、苯丙氨酸8.440mg/L的混合對照品溶液，按2.3項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸峰面積的RSD分別為0.30%、0.39%、0.97%、0.39%，表明儀器精密度良好。

2.7重復性實驗取6份苦碟子注射液（批號：110601）1.0mL，按2.2項下方法平行制成供試品溶液，按2.3項下色譜條件進樣測定，計算重復性。纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸含量分別為0.681 2、0.4159、0.3159、0.2678mg/L，RSD分別為1.3%、1.2%、2.3%、2.0%。結果表明，該方法重復性良好。

2.8穩(wěn)定性實驗取苦碟子注射液（批號：110601）按2.2項下方法制備供試品溶液6份，室溫放置，分別于放置后0、0.5、1、2、4、6 h取樣，按2.3項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。苯丙氨酸2 h后峰面積的RSD值為5.0%，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸6 h后峰面積的RSD分別為5.0%、5.5%和6.2%，表明實驗中所需樣品在短時間內(nèi)能夠保持穩(wěn)定，但仍應現(xiàn)用現(xiàn)制。

2.9加樣回收率實驗精密量取已知含量的苦碟子注射液（批號：110601）0.5mL，平行6份，分別置于10m L量瓶中，分別精密加入含有一定質(zhì)量氨基酸的混合對照品溶液，其中纈氨酸3.330μg、異亮氨酸1.592μg、亮氨酸1.728μg、苯丙氨酸1.266μg，按2.2項下方法制成供試品溶液，按2.3項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，每種氨基酸分別計算加樣回收率，結果見表3。結果符合方法學測定要求，表明本方法可準確測定供試品溶液中的氨基酸含量。

表3　4種氨基酸的加樣回收率Tab.3　Recovery ratesof four am ino acids

2.10含量測定取苦碟子注射液1.00mL，按2.2項下方法制備10批不同批號的注射液為供試品溶液，按2.3項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，計算4種氨基酸類化合物的含量，結果見表4。

表4　苦碟子注射液中4種氨基酸的質(zhì)量濃度Tab.4　Contentof four am ino acids in Kudiezi injection mg/L

3　討論與結論

苦碟子注射液的主要成分為氨基酸類、黃酮類、皂苷類和有機酸類，然而由于藥材中黃酮類成分含量較大，近期對苦碟子的研究一般集中于黃酮類成分［8-9］。但是氨基酸水平異常是缺血性腦血管疾病的發(fā)病機制之一［10］，苦碟子注射液中的氨基酸類成分在其臨床治療心腦血管疾病的過程中具有重要意義。且本實驗中測定的4種氨基酸均為人體必需氨基酸，能夠為患者提供營養(yǎng)成分和主要氮源，提高患者的生命質(zhì)量。在建立全面質(zhì)量控制方法時，對氨基酸建立可靠的分析方法極其重要。在預實驗中對常見的20種氨基酸進行了篩查［11-13］，結果發(fā)現(xiàn)必需氨基酸中纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸在苦碟子注射液中含量較大，故針對這4種氨基酸進行進一步實驗條件的優(yōu)化。

在柱前衍生化-高效液相色譜法測定氨基酸含量的過程中，衍生化后的檢測方法通?？蛇x擇熒光法或紫外法［14-15］。熒光檢測器靈敏度高，檢測限低，適用于微量乃至痕量樣品的檢測［7］，但不適用于成分復雜的中藥注射液。考慮到一機多用，降低檢測成本，提高方法的重復性和精確度，本研究選用了紫外法對苦碟子注射液中的氨基酸含量進行了測定，結果較為理想。在梯度洗脫條件下，流動相pH值及比例是保證高效液相色譜法測定氨基酸具有良好重現(xiàn)性的關鍵環(huán)節(jié)［16］。首先參考文獻［17-19］并結合本實驗中待分離氨基酸的特征，選擇pH=6.4，分離效果良好。其次由于氨基酸的極性不同，用同一梯度分離多種氨基酸，保留時間相差很大，導致分析時間過長，出峰效果不佳。經(jīng)實驗確定了最佳條件，使4種氨基酸和衍生化試劑及其衍生物在較短的時間內(nèi)被分離。此外，由于衍生化試劑與氨基酸反應的產(chǎn)物較不穩(wěn)定［20］，此類衍生化法實驗反應時間均小于2 h。故本實驗中所有樣品均應新用新制，及時進行含量測定。

分析實驗結果可發(fā)現(xiàn)，不同批次間各氨基酸成分含量差異較大，這可能與原料藥材的引種來源、種植區(qū)域、種植手段、采收季節(jié)等多個生產(chǎn)環(huán)節(jié)密切相關，提示應進一步對藥材質(zhì)量進行控制，以期全面有效地控制注射液質(zhì)量。

采用DNFB柱前衍生高效液相色譜法測定苦碟子注射液中4種氨基酸的含量，具有操作簡便易行、準確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，衍生后剩余的DNFB及其衍生物對氨基酸的測定無干擾，該方法為苦碟子注射液的質(zhì)量控制方法研究奠定了基礎。

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（本文編輯：高杉，于春泉）

Determ ination of four am ino acids in Kudieziinjection

SUN Lu，LIURui，ZHAOWen，LIYu-bo，ZHANGYan-jun
（Ti anjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］Toestablish a pre-column deriving determinationmethodwith 2，4-dinitrofluorobenzene（DNFB）for simultaneous quantification of four am ino acids（valine，isoleucine，leucine and phenylalanine）in Kudiezi injection.［M ethods］The determination was performed on a DiamonsilC18（2）column（200mm×4.6mm，5μm）.Themobile phase consisted of ultra purewater，30mmol/LNaAc（containing 1%N，N-dimethylformamide，pH=6.40）and acetonitrile with gradient elution.The flow rate was 1.0m L/min.The column temperaturewassetat25℃and the detectionwavelengthwas350 nm.［Results］Fouraminoacidsof10 batches Kudieziinjectionwere quantified and showed good linear relationship in 0.138 8～4.440，0.124 4～3.980，0.135 0～4.320 and 0.131 9～4.220mg/L，respectively. Themean recoveriesof fouressentialamino acidswere98.49%，100.60%，98.50%and 98.56%，RSD≤2.0%（n=6）.［Conclusion］The method is simp le，accurate，and reliable for quality controlof the Kudiezi injection.

Kudieziinjection；pre-column；2，4-dinitrofluorobenzene；aminoacid；HPLC

R284.2

A

1672-1519（2015）02-0106-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.02.11

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2011ZX09401-305-42）；國家自然科學基金項目（81303142）；教育部高等學校博士學科點專項科研基金項目（2012121012 0001）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃（14JCQNJC13100）。

孫璐（1990-），女，碩士研究生，主要從事中藥注射液安全性再評價及中藥新型給藥系統(tǒng)研究。

劉睿，E-mail:lr_8000@163.com；張艷軍，E-mail: zyjsunye@163.com。

（2014-09-23）