探討益肝降脂方對大鼠酒精性脂肪肝病理影響與療效的相關性*

李全征，趙遠紅，李　正，賈英杰，左曉娜，韓素恒，徐　雨，尹紀紅

探討益肝降脂方對大鼠酒精性脂肪肝病理影響與療效的相關性*

李全征1，趙遠紅2，李正3，賈英杰3，左曉娜1，韓素恒1，徐雨1，尹紀紅1

（1.天津中醫(yī)藥大學研究生院，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，天津300193；3.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室，天津300385）

［目的］通過觀察肝臟組織形態(tài)學的改變以探討求證益肝降脂方（YGJZF）對酒精性脂肪肝大鼠肝組織病理的影響及分析。［方法］實驗共分為3期，共245只雄性SD大鼠分為3個大組：空白組15只、模型組50只、中藥組180只。統(tǒng)一采用高脂飼料+乙醇灌胃法建立大鼠酒精性脂肪肝模型，并分別予以相應中藥干預，獲取各組大鼠肝臟同一位置組織制作蘇木精-伊紅（HE）染色病理切片，觀察3組大鼠肝臟組織形態(tài)學的變化。［結果］中藥各組大鼠肝組織損傷程度均較模型組輕，且兩者存在顯著差異性（P＜0.05）。［結論］YGJZF能夠減輕酒精性脂肪肝大鼠肝組織的病理損傷，對酒精性脂肪肝有肯定的保護作用。

益肝降脂方；酒精性脂肪肝；肝組織病理

近年來，隨著人們飲食結構的改變和飲酒消費的日益增長，酒精性脂肪肝在中國的發(fā)病率越來越高，且日趨低齡化［1］。數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果發(fā)現(xiàn)，世界上1 500～2 000萬的酗酒人群中約有10%～20%發(fā)生了不同程度的酒精性脂肪肝［2］。目前研究認為，乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛等可以直接或間接損害肝細胞，引發(fā)肝細胞脂肪變性和酒精性肝炎等，而這些病理改變常常是比較隱匿，一旦遷延至肝纖維化、肝硬化，其預后較差，嚴重危害人們的健康。因此，酒精性肝病的早期干預治療有著極其重要、廣泛的現(xiàn)實意義。而現(xiàn)代醫(yī)學對酒精性肝病除戒酒、對癥治療外，尚無特效規(guī)范的療法。

在長期臨床中，課題組發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在治療酒精性肝病方面具有獨特的優(yōu)勢，其“升清降濁解郁法”指導下的益肝降脂方經(jīng)前期臨床與實驗證實［3］具有較好的防治酒精性肝病作用。本文通過觀察分析益肝降脂方對3期實驗中各組大鼠肝臟組織病理改變的影響，探究中藥復方對酒精性脂肪肝的病理影響，并結合前期實驗結果，進行數(shù)據(jù)分析與判讀。

1　材料

1.1實驗動物SPF級雄性SD大鼠共245只，體質(zhì)量180～220 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院提供，動物許可證：SCXK-（軍）2007-004，飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物房。

1.2藥物及制備56°牛欄山二鍋頭，由北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；高脂飼料（1%膽固醇、10%豬油、0.3%膽酸鈉、8%蛋黃粉、80.7%基礎飼料）由中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所制作；益肝降脂方（黃芪、黃連、葛根、丹參、水紅花子、蘇葉）由天津市中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室按比例制成，含生藥1.33 g/mL的浸膏灌胃液。

1.3主要儀器和設備QP3268輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機、帆船7101玻璃載玻片、鳳凰XSP-35TV 1 600倍生物實驗顯微鏡。

2　方法

2.1動物模型建立根據(jù)研究目的實驗共分析3期，雄性SD大鼠245只，均經(jīng)預適應飼養(yǎng)（普通基礎飼料+自由進食飲水+少量生理鹽水灌胃）1周后，按照隨機數(shù)字表法分為3組：空白組15只，模型組50只，中藥組180只（其中中藥1組75只，中藥2組60只，中藥3組45只）。除空白對照組飼以普通飼料外，模型組及中藥組均采用高脂+乙醇灌胃法建立酒精性脂肪肝模型：大鼠每周測體質(zhì)量1次，并按1.5mL/100g乙醇每日早晚進行灌胃（時間間隔8h以上），所用乙醇其體積分數(shù)第1～4周為40%，第5～8周為45%，第9～12周為50%（適應性飼養(yǎng)不計入實驗周）。中藥1、2、3組分別于第3、6、9周起，乙醇灌胃后0.5h，予中藥浸膏灌胃（按每只2.66 g，分2次），相應的，從第3周起模型組予以生理鹽水灌胃。

于第6周末、第9周末、第12周末分批取材：第6周末模型組共取12只（以下記模型A組），中藥1組共取12只（以下記中藥1A組）。第9周末模型組共取12只（以下記模型B組），中藥1組共取12只（以下記中藥1B組），中藥2組共取12只（以下記中藥2B組）。第12周末將剩余大鼠全部取材（分別記以空白組，模型C組，中藥1C、2C、3C組）。隨機抽取各組大鼠，禁食水12h后稱質(zhì)量，用乙醚麻醉并目內(nèi)眥取血約5mL，脫頸處死后即取出肝臟。取部分肝右葉放于10%中性福爾馬林溶液中固定，留作病理切片。在左肝葉取約1 cm×1 cm肝組織塊以錫紙包裹存放于冰箱備份。血液樣本經(jīng)3 000 r/min離心取血清備用。

2.2觀察指標及測定方法

2.2.1一般情況觀察實驗中大鼠的精神狀況，毛發(fā)光澤度、活動情況、食量、體質(zhì)量、大小便及死亡情況等。

2.2.2病理學觀察肉眼觀察：包括肝臟大小、色澤、質(zhì)地、邊緣情況；鏡下觀察：10%中性福爾馬林溶液固定的肝組織，石蠟包埋，6μm切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后觀察大鼠肝臟病理學改變，按2010年中國醫(yī)學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組修訂的《酒精性肝病診療指南（2010年1月修訂）》［4］進行纖維化程度（S）分級，與肝細胞脂肪樣變與壞死等的程度判定。

2.2.3統(tǒng)計學處理應用SPSS 18.0通用軟件進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3　結果

3.1一般情況空白組大鼠精神狀態(tài)較好，灌胃時較溫順，皮毛光澤，行動靈活，進食及大便正常；模型組大鼠精神不振，毛發(fā)粗糙，染毒時掙扎，醉酒現(xiàn)象明顯，進食量較空白組少，大便溏泄；中藥組大鼠精神尚可，毛發(fā)光澤度較差，染毒時較配合，醉酒現(xiàn)象較模型組輕，進食量正常，大小便正常。實驗結束時，模型組大鼠死亡3只，中藥組死亡11只，其中中藥1組死亡6只，中藥2組死亡3只，中藥3組死亡2只，可能與反復飼喂或?qū)嶒炄藛T灌胃不慎嗆咳反流入氣管有關。各組大鼠體質(zhì)量情況見表1。

3.2不同時段肝臟組織病理形態(tài)學表現(xiàn)見表2和表3。

表1　各組大鼠體質(zhì)量對比（±s）Tab.1　Com parison of ratsbody weight in each group（±s）g

表1　各組大鼠體質(zhì)量對比（±s）Tab.1　Com parison of ratsbody weight in each group（±s）g

注：與空白組比較，#P＜0.05；與模型A組比較，☆P＞0.05；與模型B組比較，◆P＜0.05；與模型C組相比，▲P＜0.05；與中藥1B組比較，★P＜0.05；與中藥1C組比較，※P＜0.05。

組別　　預飼養(yǎng)后　3周末　6周末　9周末　12周末空白組　217.0±11.5　317.0±19.8　323.0±38.2　346.0±40.2　364.0±41.6模型A組　217.0±12.2　351.0±33.3　435.0±37.5　-　-中藥1A組　218.0±11.4☆　354.0±32.5☆　438.0±38.3☆　-　-模型B組　216.0±13.6　349.0±31.7　433.0±37.6　451.0±41.6　-中藥1B組　217.0±12.6◆　352.0±30.2◆　434.0±36.9◆　454.0±40.7◆　-中藥2B組　216.0±12.9★◆　350.0±32.8★◆　436.0±35.8★◆　452.0±39.8★◆　-模型C組　217.0±12.3#　352.0±31.5#　434.0±37.2#　452.0±40.5#　465.0±43.1#中藥1C組　219.0±11.7#▲　349.0±32.6#▲　432.0±35.7#▲　453.0±41.8#▲　467.0±44.2#▲中藥2C組　218.0±12.4#▲※　353.0±30.4#▲※　437.0±34.3#▲※　451.0±42.3#▲※　465.0±45.1#▲※中藥3C組　218.0±11.9#▲※　352.0±31.7#▲※　434.0±33.4#▲※　453.0±42.1#▲※　468.0±44.7#▲※

表2　各組大鼠肝臟組織學表現(xiàn)Tab.2　The ratshistologym anifestationsof liver tissue

表3　各組大鼠纖維化分期情況Tab.3　Hepatic fibrosisstaging of rats in each group

3.2.1肉眼觀察空白組肝臟顏色鮮紅，表面明亮光滑，無結節(jié)形成，邊緣銳利，各葉比例大小均正常，包膜不緊張，質(zhì)韌；模型組肝臟呈土黃色，表面暗淡，有的可見大小不等的結節(jié)，各葉比例大小是均衡，邊緣鈍，包膜緊張，質(zhì)硬；中藥組肝臟色暗略帶黃色，邊緣稍鈍，與模型組相比結節(jié)少見，各葉比例大小接近空白組，包膜不緊張，質(zhì)稍硬。

3.2.2HE染色鏡下觀察

3.2.2.1空白組肝小葉結構完整，肝細胞索排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀排列。肝細胞呈多邊形，核大而圓，位于肝細胞中央。肝竇內(nèi)及匯管區(qū)可見少量淋巴細胞浸潤，無纖維組織增生。見圖1。

圖1　空白組（HE染色×100）Fig.1　Theblank group（HE staining×100）

3.2.2.2模型C組肝小葉結構紊亂，肝細胞普遍變性，胞漿疏松，呈氣球樣變，肝血竇變狹窄，可見廣泛的脂肪變性，并有散在點狀壞死、橋接壞死甚至大片狀壞死，壞死灶及匯管區(qū)淋巴細胞浸潤，肝細胞再生較活躍，核大、深染，匯管區(qū)明顯增寬，大量的成纖維細胞、纖維細胞，增生的膠原纖維自中央靜脈及匯管區(qū)向周圍延伸，包繞肝小葉，并分割肝小葉而形成假小葉，肝血竇周圍可見纖維組織增生。見圖2。

圖2　模型C組（HE染色×100）Fig.2　ThemodelC group（HE staining×100）

3.2.2.3中藥1C組肝小葉結構規(guī)則，肝細胞成多邊形，排列較整齊，脂肪變性集中在3區(qū)，以大泡型為主，小脂滴數(shù)量較少，可見少量點狀壞死，纖維間隔較少，匯管區(qū)少量炎性細胞浸潤。見圖3。

3.2.2.4中藥2C組肝小葉結構較規(guī)則，可見肝細胞體積增大，肝血竇變窄，多見混合型的脂肪變性，中央靜脈周圍肝細胞再生活躍，核大，胞脂深染，可見少量嗜酸性變、點狀壞死，匯管區(qū)可見大量炎性細胞浸潤及纖維增生。見圖4。

圖3　中藥1C組（HE染色×100）Fig.3　The YGJZF 1C group（HE staining×100）

圖4　中藥2C組（HE染色×100）Fig.4　TheYGJZF 2C group（HE staining×100）

3.2.2.5中藥3C組肝小葉結構不規(guī)則，肝細胞體積增大，胞漿淡染，染色質(zhì)呈顆粒狀，甚至呈氣球樣變，肝血竇變窄，可見廣泛的混合型脂肪變性，中央靜脈周圍肝細胞再生活躍，核大，散在點狀壞死甚至橋接壞死，匯管區(qū)可見大量炎性細胞浸潤及纖維增生，有假小葉形成。見圖5。

4　討論

2012亞太肝病年會紀要［5］強調(diào)乙醇是許多疾病包括肝癌的危險因素。長期大量飲酒可導致肝臟組織病理不同程度的改變，包括脂肪變性、肝細胞腫脹壞死、肝細胞凋亡、炎癥細胞浸潤、肝纖維化等。酒精肝診斷的“金標準”是肝組織的病理變化［4］，從輕癥酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎及肝纖維化到肝硬化有其特征性病理改變，因此本實驗通過模擬人類日益嚴重的長期大量飲酒、高脂飲食的不良生活模式，采用成熟的造模方法［6］從肝組織病理學結果證明SD大鼠酒精性脂肪肝造模成功及可重復性，比對分析中藥的干預效果。

圖5　中藥3C組（HE染色×100）Fig.5　The YGJZF 3C group（HE staining×100）

酒精性肝病病因明確但發(fā)病機制復雜，目前尚未完全清楚，一般認為與乙醇及其代謝產(chǎn)物對肝臟的毒性作用、氧化應激、免疫介導、細胞因子、細胞凋亡、內(nèi)毒素［7］、以及病毒的疊加、遺傳等多種因素有關［8］。目前廣為接受的理論是Day等［9］提出的“二次打擊”學說。研究表明，氧化應激和脂質(zhì)過氧化作用在酒精性肝病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用［10］。課題組前期實驗中［11-14］，通過對酒精性脂肪肝大鼠丙二醛（MDA）、黃嘌呤氧化酶（XO）［15］、異前列腺素（8-iso-PGF2α）表達的檢測，發(fā)現(xiàn)益肝降脂方具有明確的降低三者的作用，從而推斷益肝降脂方的保護機制，可能與其抗過氧化作用［16］有關。

眾所周知，肝組織活檢不僅能明確診斷，正確區(qū)分單純性脂肪肝亦或脂肪性肝炎，同時也可對肝組織進行分級分期［17］。通過對大鼠肝臟組織病理染色，記錄觀察各組SD大鼠酒精性脂肪肝變性和肝纖維化的分期分級，更直觀的反映出益肝降脂方對酒精性脂肪肝大鼠肝組織的影響。結果顯示：模型組大鼠酒精性肝病病理損傷呈現(xiàn)逐漸進展的趨勢，隨造模時間延長肝組織脂肪變進行性加重。而中藥組肝組織損傷較模型組輕，且進展緩慢。通過中藥各組組間對比，發(fā)現(xiàn)中藥干預時間越早，肝損傷程度越輕，其療效與病理損傷呈現(xiàn)出相關性。

通過對3期實驗的肝組織病理學全面分析，證實益肝降脂方具有明顯的拮抗酒精肝病理損傷的作用，與評價氧化應激和脂質(zhì)過氧化的特異標志物8-iso-PGF2α活性表達呈現(xiàn)出趨勢上的平行一致［18］。

［1］劉維明，王玉娟，劉相花，等.清脂顆粒治療酒精性脂肪肝的臨床研究［J］.世界中西醫(yī)結合雜志，2013，8（12）:1223-1225.

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（本文編輯：馬英，高杉）

Investigation on the correlation of the effectof Y igan Jiangzhi Fang on pathology in ratsw ith alcoholic fatty liver

LIQuan-zheng1，ZHAOYuan-hong2，LIZheng3，JIAYing-jie2，ZUOXiao-na1，HANSu-heng1，XUYu1，YIN Ji-hong1
（1.DepartmentofPostgraduate，Tianjin University of TraditionalChinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.DepartmentofOncology，The FirstAffiliated Hospitalof Tianjin University of TraditionalChineseMedicine，Tianjin 300193，China；3.DrugManufacturingRoom，The First Affiliated Hospitalof Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300385，China）

［Ob jective］To observe themorphological changes of liver tissue in order to discuss and verify the pathology effects on liver tissue of Yigan Jiangzhi Fang（YGJZF）on alcoholic fatty liver in rats.［M ethods］The experimentswere divided into 3 stages.A totalof 245male SD ratswere random ly divided into 3 groups:blank group 15，model group 50，YGJZFgroup 180.Ratswere given fat dietand alcohol feeding to establish alcoholic fatty livermodel，and were separately corresponding intervention，rats in each group were stained with HE tomake pathologicalslicesat the same position of liver tissue，observed the changesofmorphological liver tissue of three groups of rats.［Results］The degree of rats liver tissue injury in YGJZF group was lighter than in themodel group，and the difference was statistically significant.［Conclusion］YGJZF can reduce the pathological injury of liver tissue ofalcoholic fatty liver in rats，hasa positive protection effecton alcoholic fatty liver.

Yigan JiangzhiFang；alcoholic fatty liver；hepatic tissue pathology

R575.5

A

1672-1519（2015）02-0093-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.02.08

天津市應用基礎及前沿技術重點項目（11JCZD JC19900）。

李全征（1987-），碩士研究生，主要研究方向為常見肝?。[瘤）的臨床與實驗研究。

趙遠紅，E-mail:yuanhongzh98@163.com。

（2014-10-11）