補(bǔ)腎藥與祛風(fēng)藥配伍控制狼瘡小鼠狼瘡腎炎進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)研究*

王　丹，趙　浩，薛　鸞，劉　霽

補(bǔ)腎藥與祛風(fēng)藥配伍控制狼瘡小鼠狼瘡腎炎進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)研究*

王丹1，趙浩2，薛鸞1，劉霽1

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院風(fēng)濕科，上海200437；2.上海長(zhǎng)寧區(qū)光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院急診類(lèi)風(fēng)關(guān)科，上海200092）

［目的］觀察補(bǔ)腎中藥與祛風(fēng)中藥配伍對(duì)狼瘡小鼠病情活動(dòng)的影響。［方法］50只MRL/lpr狼瘡小鼠隨機(jī)分為5組，補(bǔ)腎組、祛風(fēng)組、補(bǔ)腎祛風(fēng)組、西藥組、生理鹽水組，同時(shí)設(shè)置10只BAbl/c小鼠對(duì)照。分別給予對(duì)應(yīng)的中西藥物治療6周，觀察小鼠體質(zhì)量、尿蛋白、尿紅細(xì)胞、尿白細(xì)胞及雙鏈（天然）脫氧核糖核酸（ds-DNA）、白介素-17（IL-17）變化。［結(jié)果］各組小鼠隨著周齡增長(zhǎng)體質(zhì)量均有增加，其中祛風(fēng)組增加較少，與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各給藥組ds-DNA水平低于生理鹽水組（P＜0.05）。補(bǔ)腎祛風(fēng)組ds-DNA下降明顯，優(yōu)于其他各給藥組（P＜0.05）。與生理鹽水組比較，其他各給藥組IL-17下降明顯（P＜0.05），且補(bǔ)腎祛風(fēng)組優(yōu)于西藥組，西藥組優(yōu)于補(bǔ)腎組及祛風(fēng)組（P＜0.05）。尿常規(guī)情況，生理鹽水組7只小鼠出現(xiàn)紅細(xì)胞，其他各組與生理鹽水組比只數(shù)較少，但各組與生理鹽水組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.003 12）。生理鹽水組所有小鼠均出現(xiàn)尿蛋白陽(yáng)性，與其他各組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.003 12）；除生理鹽水組，其他各給藥組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.003 12）。［結(jié)論］補(bǔ)腎藥與祛風(fēng)藥配伍能明顯降低狼瘡小鼠IL-17和ds-DNA表達(dá)，起到控制狼瘡腎炎的作用，效果優(yōu)于單獨(dú)使用補(bǔ)腎藥和祛風(fēng)藥。

補(bǔ)腎藥；祛風(fēng)藥；狼瘡小鼠；狼瘡腎炎

近幾年系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的治療已發(fā)展到靶向治療，但糖皮質(zhì)激素依然是不可替代的治療藥物，有關(guān)此方面的研究不僅涉及效益與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，同時(shí)如何減輕糖皮質(zhì)激素的不良反應(yīng)，也被臨床醫(yī)生所重視。在糖皮質(zhì)激素應(yīng)用的同時(shí)，防治骨質(zhì)疏松藥物、保護(hù)胃黏膜藥物被廣泛使用。而中藥在SLE中的應(yīng)用有著多年的歷史，可以增強(qiáng)臨床療效，并起到減少感染、減輕激素引起的興奮、失眠、胃潰瘍等不良反應(yīng)。筆者在臨床實(shí)踐中采用補(bǔ)腎藥和祛風(fēng)藥配伍，能使患者蛋白尿得到較快的控制，為進(jìn)一步觀察藥物配伍的作用及其可能起效機(jī)制，采用MRL/lpr狼瘡小鼠為模型，給予中藥治療，對(duì)小鼠的腎炎情況及白介素-17（IL-17）水平進(jìn)行了觀察，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物8周齡SPF級(jí)雌性MRL/lpr狼瘡小鼠，由中科院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心引種培育。SPF級(jí)Babl/c小鼠購(gòu)自中科院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。飼養(yǎng)于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)隔離飼養(yǎng)間。

1.1.2藥物組成補(bǔ)腎藥采用六味地黃丸，按組方由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室制成每毫升含生藥1.5 g的水煎劑。祛風(fēng)藥采用蟬蛻、防風(fēng)、白蒺藜等，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室制成每毫升含生藥1.5 g的水煎劑。補(bǔ)腎藥與祛風(fēng)藥的合劑按上述工藝制備。西藥采用甲強(qiáng)龍，由輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院西藥房提供。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與給藥采用Excel生成隨機(jī)數(shù)字，將50只MRL/lpr狼瘡小鼠隨機(jī)分為5組，補(bǔ)腎組、祛風(fēng)組、補(bǔ)腎祛風(fēng)組、西藥組、生理鹽水組，同時(shí)設(shè)置10只Babl/c小鼠為對(duì)照組。確定臨床患者每日所需劑量，根據(jù)徐淑云主編的《藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法》，按公式：小鼠劑量（g/kg）=人用劑量×0.0026×50 g計(jì)算，由于補(bǔ)腎藥和祛風(fēng)藥所采用的劑量不同，所以最終給藥總毫升數(shù)不同，補(bǔ)腎組給藥0.3mL，祛風(fēng)組給藥0.2mL，補(bǔ)腎祛風(fēng)組給藥0.5mL，西藥組給藥0.5mL，生理鹽水組0.5mL，Babl/c小鼠給予生理鹽水0.5mL。共給藥6周。

1.2.3觀察指標(biāo)每2周測(cè)1次小鼠體質(zhì)量，并檢測(cè)尿常規(guī)1次，樣本送上海天祥醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所檢測(cè)，儀器：桂林優(yōu)利特Uritest500B尿常規(guī)檢測(cè)儀，試劑：優(yōu)利特G系列尿試紙，試紙批號(hào)：G1112013。給藥6周后，眼球取血處死小鼠，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)血清雙鏈（天逸）脫氧核糖核酸（ds-DNA）、IL-17。IL-17試劑盒批號(hào)1212304，ds-DNA試劑盒批號(hào)1212305，均為RND分裝試劑盒。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較檢驗(yàn)采用LSD法，重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間率的分析采用Fisher精確法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.003 12。

2　結(jié)果

2.1各組小鼠體質(zhì)量變化情況各組小鼠隨著周齡增長(zhǎng)體質(zhì)量均有增加，第42天和入組時(shí)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中祛風(fēng)組增加較少，與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1　各組小鼠體質(zhì)量變化情況（±s）Tab.1　Changes in bodyw eight ofm ice in each group（±s）g

表1　各組小鼠體質(zhì)量變化情況（±s）Tab.1　Changes in bodyw eight ofm ice in each group（±s）g

注：與組內(nèi)第1天比較，*P＜0.01；與生理鹽水組比較，#P＜0.05；與對(duì)照組比較，△P＜0.05。

組別　　第1天　　第14天　　第28天　　第42天補(bǔ)腎組　23.12±1.35　25.33±1.69　27.87±1.17　27.66±1.82*△祛風(fēng)組　22.91±2.03　23.22±1.79　24.78±2.14　25.15±1.88*#△補(bǔ)腎祛風(fēng)組　23.01±1.76　27.32±2.81　27.48±2.23　28.45±2.75*西藥組　22.36±2.15　24.72±2.09　26.67±1.94　27.01±1.58*△生理鹽水組　22.15±2.17　25.77±2.08　26.58±1.94　28.75±2.09*對(duì)照組　23.77±1.84　26.88±1.76　28.29±2.01　30.46±2.15*

2.2各組小鼠ds-DNA及IL-17表達(dá)情況各給藥組ds-DNA水平低于生理鹽水組；補(bǔ)腎祛風(fēng)組ds-DNA下降明顯，優(yōu)于其他各給藥組（P＜0.05）；補(bǔ)腎組和西藥組的ds-DNA表達(dá)未見(jiàn)明顯差異，但西藥組有下降明顯的趨勢(shì)；與生理鹽水組比較，其他各給藥組IL-17下降明顯（P＜0.05），且補(bǔ)腎祛風(fēng)組優(yōu)于西藥組，西藥組優(yōu)于祛風(fēng)組及補(bǔ)腎組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2　小鼠ds-DNA及IL-17表達(dá)情況（±s）Tab.2　Expression of ds-DNA and IL-17 ofm ice in each group（±s）pg/m L

表2　小鼠ds-DNA及IL-17表達(dá)情況（±s）Tab.2　Expression of ds-DNA and IL-17 ofm ice in each group（±s）pg/m L

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05；與補(bǔ)腎祛風(fēng)組比較，#P＜0.05；與西藥組比較，△P＜0.05。

組別　ds-DNA　IL-17補(bǔ)腎組　25.20±2.78*#　54.98±3.67*#△祛風(fēng)組　26.32±2.68*#　52.38±4.82*#補(bǔ)腎祛風(fēng)組　20.93±1.95*　45.66±4.29*西藥組　23.49±2.93*#　50.69±2.58*#生理鹽水組　29.90±2.31#　70.83±4.91#對(duì)照組　10.98±1.03　38.52±2.47

2.3尿常規(guī)測(cè)定情況檢測(cè)尿常規(guī)，觀察各組出現(xiàn)紅細(xì)胞、白細(xì)胞、或蛋白尿小鼠的數(shù)目。狼瘡小鼠隨著病程進(jìn)展，生理鹽水組7只小鼠出現(xiàn)紅細(xì)胞，紅細(xì)胞發(fā)生率為70%，其他各組紅細(xì)胞發(fā)生率較低，但所有組與生理鹽水組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.01＞0.003 12）；生理鹽水組所有小鼠均出現(xiàn)尿蛋白陽(yáng)性，與其他各組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.003＜0.003 12）。除生理鹽水組，其他各給藥組之間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。各組白細(xì)胞比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表3。

3　討論

SLE作為比較棘手的自身免疫性疾病，臨床起病隱匿，變化迅速。盡管目前已有多種藥物和多種手段應(yīng)用于SLE的治療，但由于疾病在穩(wěn)定的情況下會(huì)突然發(fā)生變化，并且激素和免疫抑制劑的應(yīng)用使得SLE的死亡原因發(fā)生了改變，因此如何減輕藥物不良反應(yīng)和降低疾病復(fù)發(fā)幾率，依然是風(fēng)濕界不斷探索的問(wèn)題。

中藥治療SLE有多年的歷史，治療原則大體可分為補(bǔ)益脾腎和清熱解毒［1-4］。筆者采用補(bǔ)腎祛風(fēng)的治療方法，源于王慶其教授“頑病治風(fēng)”的理念［5-7］，因“風(fēng)為百病之長(zhǎng)，善行而數(shù)變”，這與SLE臨床變化多端的特點(diǎn)不謀而合。而補(bǔ)腎法在SLE中亦有廣泛應(yīng)用，包括補(bǔ)腎陰、補(bǔ)腎陽(yáng)以及陰陽(yáng)雙補(bǔ)。中醫(yī)認(rèn)為“腎生髓、髓生血”，骨髓的造血干細(xì)胞是各種免疫細(xì)胞的來(lái)源。從現(xiàn)代藥理學(xué)角度，祛風(fēng)藥被認(rèn)為有抗變態(tài)反應(yīng)作用［8-9］，而多數(shù)補(bǔ)腎中藥，能調(diào)節(jié)垂體-腎上腺軸，改變免疫狀態(tài)［10-12］。

對(duì)MRL/lpr狼瘡小鼠給予不同中藥治療，結(jié)果顯示各組小鼠體質(zhì)量均有增加，僅祛風(fēng)組小鼠的體質(zhì)量增加稍低于其他各組，祛風(fēng)藥有利水消腫的作用，實(shí)驗(yàn)中的小鼠并未觀察到明顯水腫或腹水，但并不排除有內(nèi)臟水腫的存在，但補(bǔ)腎祛風(fēng)組小鼠的體質(zhì)量高于祛風(fēng)組，因此祛風(fēng)組體質(zhì)量偏輕的原因尚不能解釋。給藥過(guò)程中，西藥組在第13周有1只小鼠死亡，對(duì)死亡小鼠進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)腎臟及脾臟均存在明顯的腫脹，肺部有感染，可能是由于糖皮質(zhì)激素應(yīng)用并發(fā)感染，也可能因灌藥不慎引起。從理論上講，MRL/lpr小鼠在6月齡左右開(kāi)始出現(xiàn)死亡［13］，本研究采用8周齡小鼠進(jìn)行研究，小鼠處于發(fā)病初期，病情較輕，由疾病本身導(dǎo)致死亡的可能性不大。

表3　各組小鼠尿常規(guī)情況Tab.3　Urine convention ofm ice in each group

臨床上狼瘡腎炎可表現(xiàn)為慢性腎小球腎炎、腎病綜合征等，補(bǔ)腎藥可明顯減輕頑固性蛋白尿［14］，本研究發(fā)現(xiàn)各給藥組均有改善狼瘡腎炎的作用，有降低ds-DNA、減少蛋白尿的作用，其中補(bǔ)腎祛風(fēng)組效果相對(duì)明顯。這與祛風(fēng)中藥有抗變態(tài)反應(yīng)的作用可能有關(guān)，提示在補(bǔ)腎藥基礎(chǔ)上加予祛風(fēng)藥有助于緩解狼瘡腎炎。筆者將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步對(duì)腎臟進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)。

IL-17是由Th17分泌的促炎性細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)免疫和炎癥應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，已有研究證實(shí)，IL-17在多種自身免疫性疾病中表達(dá)增高，處于活動(dòng)期的SLE患者IL-17水平明顯高于穩(wěn)定期患者［15-16］。NZB/W F1狼瘡小鼠是國(guó)際公認(rèn)的研究SLE的經(jīng)典動(dòng)物模型，已經(jīng)證實(shí)［17-19］NZB/W F1狼瘡小鼠在發(fā)病過(guò)程中產(chǎn)生的自身抗體，以及腎臟病理?yè)p害均與人類(lèi)SLE非常相似，存在IL-6、IL-17等多種細(xì)胞因子的異常表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在MRL/lpr狼瘡小鼠中IL-17的表達(dá)水平明顯高于Babl//c小鼠，經(jīng)藥物治療后各組均有下降，其中補(bǔ)腎祛風(fēng)組較為明顯，這與觀察小鼠蛋白尿緩解情況一致，提示IL-17可能是藥物起效的途徑之一。

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（本文編輯：馬英，高杉）

Experimentalstudy on compatibility of invigorating kidney herbsand dispellingwind herbsused in lupusm ice to control the progressof lupusneph ritis

WANGDan1，ZHAOHao2，XUELuan1，LIUJi1

（1.Departmentof Rheumatology，Yueyang Hospitalof Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，ShanghaiUniversity of TraditionalChineseMedicine，Shanghai200437，China；2.DepartmentofArthritis Emergency，Guanghua IntegrativeMedicine Hospital in Changning District，Shanghai200092，China）

［Objective］Toobserve the effectsof compatibility of invigorating kidney herbsand dispellingwind herbs used in lupusmice.［M ethods］Fifty lupusmice were random ly divided into five groups，and they were invigorating kidney group，dispelling wind group，invigorating kidney and dispellingwind group，medicine group and normal saline group.Another10 BAbl/cmicewere used to compare. Each group wasgiven the corresponding herbsandmedicine for sixweeks.［Results］Theweightof themice in each group increased with weeks growth，the dispelling wind group increased lower significantly than other groups（P＜0.05）.The level of ds-DNA in groups that given herbs andmedicinewas lower than in normal saline group（P＜0.05）.The level of ds-DNA in invigorating kidney and dispelling wind group declined significantly than other groups（P＜0.05）.The level of IL-17 in groups that given herbs and medicine declined significantly than normal saline group（P＜0.05），and the invigorating kidney and dispellingwind group was lower thanmedicine group which was lower than invigorating kidney group，dispelling wind group，but no difference among each group.There were sevenmice of normalsalinegroup occurred erythrocytes in urinewhichwasmore than othergroups，butno differenceamong each group（P＞0.003 12）. All them ice ofnormal saline group appeared urinary protein which weremore than other groups（P＜0.003 12）and therewasno difference between the groupsexceptnormal saline group（P＞0.003 12）.［Conclusion］Compatibility of invigorating kidney herbs and dispelling wind herbs can control the development of lupus nephritis through the way of declining the expression of IL-17 and ds-DNA in Lupus Micesignificantly，which effectswerebetter than using invigoratingkidney herbsor dispellingwind herbsalone.

invigorating kidney herb；dispellingwind herb；lupusmice；lupusnephritis

R593.24

A

1672-1519（2015）02-0098-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.02.09

上海市教委資助項(xiàng)目（2011JW46）。

王丹（1980-），女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療風(fēng)濕病的臨床和基礎(chǔ)研究。

（2014-09-27）