富組氨酸糖蛋白基因多態(tài)性與中國婦女卵巢反應(yīng)性的相關(guān)性初探

金白靈，牛志宏，馮云＊

（1.上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院生殖中心；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院瑞金臨床醫(yī)學(xué)院，上海 200024）

體外受精（IVF）能夠成功的關(guān)鍵步驟之一，是通過使用外源性促性腺激素（Gn），使卵巢內(nèi)多個卵泡同時發(fā)育，得到數(shù)個高質(zhì)量的卵母細(xì)胞。卵巢對Gn的反應(yīng)性受到多種因素的影響，如年齡、體重指數(shù)（BMI）、基礎(chǔ)卵泡刺激素（FSH）、抗苗勒管激素（AMH）、竇卵泡計數(shù)（AFC）等。其中，目前公認(rèn)預(yù)測卵巢反應(yīng)性最可靠的指標(biāo)為AMH 和AFC［1］。然而，即使在AMH 和AFC 均無異常的年輕患者中，仍有15%左右會對Gn出現(xiàn)“意料之外”的反應(yīng)不佳，提示存在上述指標(biāo)以外的因素能夠影響卵巢的反應(yīng)性［2］。

近年來基因多態(tài)性的研究使人們對個體化差異有了更深入的認(rèn)識，而基因測序技術(shù)的普及也使得個體化治療成為趨勢。在輔助生殖方面，搜尋影響卵巢反應(yīng)性的基因多態(tài)性，為個體化制定促排方案提供依據(jù)是近年來的熱點之一。目前已知有FSH受體［3］、雌激素受體［4］、黃體生成素（LH）［5］等基 因的多態(tài)性可能影響卵巢對外源性Gn的反應(yīng)性。

本文所研究的富組氨酸糖蛋白（histidine-rich glycoprotein，HRG）基因，因其在血管形成和凝血通路上的重要作用而被廣泛研究［6］。該基因重要的多態(tài)性位于633 位點上，C 被T 替代，使其編碼的蛋白相應(yīng)位置上脯氨酸被絲氨酸替代，而后者可以被高度糖化，可能影響到該蛋白的穩(wěn)定性甚至生理功能［6］。近期國外一些小樣本研究發(fā)現(xiàn)，相較于HRG C／C、C／T 基因型，T／T 基因型的女性臨床妊娠率較低，復(fù)發(fā)流產(chǎn)的危險性較高，在體外受精前的超排卵周期中獲卵數(shù)減少［7-9］。本文旨在探索HRG多態(tài)性對中國不孕女性超排卵周期結(jié)局的影響，為個性化制定促排方案、提高卵巢反應(yīng)性提供新的思路。

資料與方法

一、研究對象

2014年1月～6月在我院接受體外受精-胚胎移植（IVF-EF）助孕的中國漢族女性，共納入107名女性。

1.納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）中國漢族女性；（2）輸卵管因素為唯一的IVF 指證；（3）月經(jīng)周期規(guī)律；（4）年齡≤36 歲，18＜BMI＜26kg／m2；（5）基礎(chǔ)FSH≤10U／L；（6）男方精液符合WHO 2010年第5版正常精液標(biāo)準(zhǔn)；（7）采用黃體期長方案促排；（8）使用第一代IVF技術(shù)。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）單卵巢；（2）多囊卵巢綜合征（依據(jù)2003 年鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn)）；（3）存在直徑≥2cm的卵巢囊腫；（4）輸卵管積水。

二、控制性超排卵與IVF

1.促排卵方案：于超排卵周期前一周的黃體中期（預(yù)計月經(jīng)來潮前7d）起，使用GnRH 短效激動劑（達(dá)必佳TM，F(xiàn)erring，Germany）降調(diào)節(jié)，起始劑量每天0.1 mg 肌 肉 注 射，使 用7d 后 減 少 至 每 天0.05mg肌肉注射，持續(xù)至取卵日。超排卵周期第3天起，根據(jù)女性年齡、BMI、基礎(chǔ)性激素水平、竇卵泡計數(shù)（AFC）制定初始Gn劑量，150～300U／d，藥物選擇rhFSH（果納芬TM，Merck Serono，Swiss），適當(dāng)添加尿人絕經(jīng)期促性腺激素（HMG，賀美奇TM，F(xiàn)erring，Germany）。用藥后第4～5天起隔兩天或隔天監(jiān)測血清雌激素、孕酮和LH 水平，并經(jīng)陰道超聲監(jiān)測卵泡生長情況，以觀察藥物效果并個體化調(diào)節(jié)后續(xù)用藥劑量。當(dāng)直徑≥1.8cm 的卵泡數(shù)量≥3枚時，當(dāng)晚肌肉注射人絨毛膜促性腺激素（HCG，珠海麗珠）5 000～10 000 U，注射后36h 行陰道B超，經(jīng)陰道穿刺取卵術(shù)。

2.IVF及胚胎評分：取卵后4h，將用改良上游法處理后的精子加入到含有卵冠丘復(fù)合體的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。受精后18 h脫去卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞，觀察原核形成情況，觀察到雙原核（2PN）出現(xiàn)為正常受精。取卵后72h根據(jù)胚胎的卵裂球數(shù)目、大小均一性及碎片程度進(jìn)行胚胎形態(tài)學(xué)評分［10］：（1）卵裂球數(shù)目：8～10為4分，6～7為3分，5為2分，≤4為0分；（2）卵裂球的對稱性：卵裂球大小均勻或略不均勻為1分，不均勻為0分；（3）碎片評分：碎片占胚胎體積＜5%為4分，5%～10%為3分，11%～25%為2分，26%～50%為1分，＞50%為0 分。3 部分得分總和即為胚胎評分，≥5分視為優(yōu)質(zhì)胚胎。受精率：受精卵數(shù)／獲卵數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率：優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)／卵裂數(shù)×100%。

三、基因型測定

1.樣本：取卵當(dāng)天抽取2 ml靜脈血，提取DNA，保存于-80 ℃待用。

2.引物：正向5’-ATTTTGAATTCTCATACTGCCTTA -3’；反向5’-CTCTT TCTTTTTTCTCTGTGACTCT-3’。

3.PCR：（1）反 應(yīng) 體 系：50 μl體 系 中 含 模 板1μl，正反相引物各1μl，dNTP 10 mmol／L 1μl，Taq Buffer 5μl，Taq酶5U／μl 0.5μl，25mmol／L MgCl25μl；（2）反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55 ℃退 火35s，72 ℃延 伸40s，循 環(huán)35次，72 ℃延伸8min。

4.測序：PCR 產(chǎn)物純化回收（生工SK1141試劑盒，生工生物工程），由生工生物工程（上海）公司測序。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料結(jié)果表示采用（±s），各基因組患者的基本特征資料及卵巢反應(yīng)性指標(biāo)的比較，采用各組兩兩間方差齊性檢驗后獨立t檢驗；計數(shù)資料用個數(shù)（頻率）表示，用卡方檢驗或Fisher精確分析法（當(dāng)＞20%格子理論頻數(shù)≤5時）進(jìn)行比較；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基因型測定結(jié)果

測序圖譜見圖1。C／C、C／T 及T／T 基因型各有31、70、6人，頻率分別為30.0%、64.4%、5.6%。C和T 的等位基因頻率分別為61.7%和38.3%。

各基因型患者的基本特征見表1。各組間患者的年齡、BMI、基礎(chǔ)性激素水平、AFC 無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；原發(fā)不孕與繼發(fā)不孕患者在各組的比例無顯著差異（P＞0.05）。此外，納入女性中僅5人（均為C／T 基因型）為第2次促排，其余均為首次接受促排卵患者。

箭頭所示為HRG633 位點，藍(lán)色單峰為C／C純合子（下行），紅色單峰為T／T 純合子，紅藍(lán)套疊雙峰且兩峰高度差＜50%為C／T 雜合子（上行）。

二、各基因組患者促性腺激素（Gn）使用情況比較

C／C、T／T 及C／T 基因型患者Gn平均初始劑量分別為2.44 支、2.67 支及2.39支每天，各組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。促排總天數(shù)3 組相似（11.9dvs.11.7dvs.12.3d）。但T／T 組Gn總消 耗 量 顯 著 高 于C／C 組（34.6 vs.26.4，P ＝0.021），與C／T 組比消耗量較大，但無統(tǒng)計學(xué)差異（34.6vs.28.3，P＝0.141）。此外，使用的Gn中，HMG 消耗量T／T 組同樣顯著高于C／C 組（14.0 vs.9.3，P＝0.047），與C／T 組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（14.0vs.11.7，P＝0.42）。C／C 組與C／T 組的Gn總消耗量及HMG 消耗量無顯著差異（P＞0.05）（表2）。

三、超排卵結(jié)局比較

T／T 基因型患者的獲卵數(shù)（T／T vs.C／T，T／T vs.C／C分別為9.7vs.14.6，9.7vs.14.5，P 均小于0.05）、受精卵數(shù)（T／T vs.C／T，T／T vs.C／C 分別為6.1vs.10.2，6.1vs.11.0，P 均小于0.05）、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)（T／T vs.C／T，T／T vs.C／C 分別為3.0vs.7.0，3.0vs.7.4，P 均小于0.05）均顯著低于另外兩種基因型患者（P＜0.05）。T／T 組的受精率 顯 著 低 于C／C 組（63.7% vs.75.6%，P ＝0.034），與C／T 組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（63.7%vs.71.1%，P＝0.314）。T／T 組優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著低于C／T 組（49.2%vs.68.7%，P＝0.04），較C／C 組低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（49.2%vs.66.6%，P＝0.075）。C／T、C／C 基因型兩組間上述結(jié)果均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（表3）。

圖1 HRG 基因測序圖譜（片段）

表1 HRGC633TC／C、T／T 及C／T 基因型患者基本特征［（±s），n（%）］

表1 HRGC633TC／C、T／T 及C／T 基因型患者基本特征［（±s），n（%）］

基因型 例數(shù) 頻率 年齡（歲） BMI（kg／m2）原發(fā)不孕 繼發(fā)不孕C／C 31 31（30.0） 29.0±3.2 22.5±3.1 17（54.8） 14（45.2）C／T 70 70（65.4） 29.2±4.6 20.9±2.6 46（65.7） 24（34.3）T／T 6 6（5.4） 30.1±4.5 21.9±3.6 4（66.7） 2（33.3）基因型 例數(shù) 不孕年限 基礎(chǔ)FSH（U／L） 基礎(chǔ)LH（U／L） 基礎(chǔ)E2（pmol／l） 竇卵泡數(shù)（個）C／C 31 3.4±1.5 7.0±1.3 4.6±2.5 129.5±67.2 13.8±3.2 C／T 70 2.5±1.4 7.3±1.9 4.2±1.3 157.1±34.1 12.5±3.0 T／T 6 3.5±2.0 8.3±1.4 5.2±2.7 132.5±64.6 13.7±3.1

表2 HRGC633TC／C、T／T 及C／T 基因型患者Gn使用情況比較［（±s），n（%）］

表2 HRGC633TC／C、T／T 及C／T 基因型患者Gn使用情況比較［（±s），n（%）］

注：與C／C組比較，＊P＜0.05

基因型 例數(shù) 頻率 Gn初始劑量（支／d） Gn使用天數(shù)（d） Gn總消耗量（支） HMG 消耗量（支）C／C 31 31（30.0）2.44±0.63 11.9±3.8 26.4±6.2 9.3±4.0 C／T 70 70（65.4） 2.39±0.72 12.3±2.0 28.3±9.7 11.7±6.4 T／T 6 6（5.6） 2.67±0.68 11.7±2.3 34.6±13.3＊ 14.0±9.2＊

表3 HRGC633TC／C、T／T 及C／T 基因型患者超排周期結(jié)局的比較［（±s），n（%）］

表3 HRGC633TC／C、T／T 及C／T 基因型患者超排周期結(jié)局的比較［（±s），n（%）］

注：與C／C和C／T 組比較，＊P＜0.05；與C／C組比較，＃P＜0.05；與C／T 組比較，△P＜0.05

基因型 例數(shù) 頻率 獲卵數(shù)（枚） 受精卵數(shù)（枚） 優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)（枚） 受精率（%） 優(yōu)質(zhì)胚胎率（%）C／C 31 31（30.0） 14.5±4.6 11.0±3.8 7.4±3.3 75.6±11.4 66.6±20.3 C／T 70 70（65.4） 14.6±4.4 10.2±3.7 7.0±3.2 71.1±17.4 68.7±21.6 T／T 6 6（5.6） 9.7±2.3＊ 6.1±2.1＊ 3.0±2.0＊ 63.7±15.8＃ 49.2±26.3△

討 論

HRG 蛋白廣泛參與凝血、免疫、細(xì)胞凋亡、血管形成等生理過程［6］，而上述過程對于卵泡發(fā)育、成熟、胚胎發(fā)育等至關(guān)重要。值得一提的是，已有研究發(fā)現(xiàn)HRG 蛋白同樣存在于卵泡液中［11］。

HRG 蛋白存在兩個異構(gòu)體，殘端分別為絲氨酸和脯氨酸，前者可以被高度糖化，因此質(zhì)量相對較大，可以在免疫蛋白電泳中與另一異構(gòu)體分離。兩個異構(gòu)體是由于第633位上C／T 多態(tài)性，因此存在3個基因型：C／C，C／T，T／T。前期研究表明，T／T基因型女性的妊娠率較其它兩型低［9］，而復(fù)發(fā)性流產(chǎn)危險性增加［7］，使該基因多態(tài)性在女性輔助生育領(lǐng)域初受關(guān)注。近期Nordqvist等［8］的一項研究統(tǒng)計了67位因不明原因不孕接受IVF 的白人女性，發(fā)現(xiàn)T／T 基因型的患者獲卵數(shù)較少，提示該基因型可能影響了卵巢反應(yīng)性。

本研究為在中國人群中研究HRG 多態(tài)性對超排卵周期結(jié)局的影響。共納入了107名在本中心接受體外受精輔助生育，并接受長方案促排的不孕女性，按C／C、C／T、T／T 3種基因型分組。各組患者的年齡、BMI、基礎(chǔ)性激素水平、AFC 都在正常范圍，且各組間上述指標(biāo)無差異，而原發(fā)與繼發(fā)不孕在各組的比例相似，基本排除了這些因素對結(jié)果的影響。T／T 基因型的患者，即使Gn總消耗量高于C／T 組和C／C 組，獲卵數(shù)卻明顯少于另外兩組，提示T／T 基因型可能影響了卵巢的反應(yīng)性。該發(fā)現(xiàn)支持了Nordqvist等［8］的研究結(jié)果。進(jìn)一步分析，T／T 基因型患者的受精卵數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)也顯著低于于另外兩組，而該差異不僅是基于獲卵數(shù)的減少，也和T／T 基因型的受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率降低有關(guān)，在本研究保證了精子質(zhì)量的前提下，提示T／T 基因型可能也影響了卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育。

HRG633T 多態(tài)性編碼的蛋白，在204位上為絲氨酸，使該位點可被糖化［12］，而該糖化反應(yīng)可能影響了HRG 蛋白與多個配子或其它細(xì)胞因子之間的相互作用。已知HRG 通過與血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）共同作用參與了血管生成過程［13］，而血管形成過程對卵泡和卵母細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要［14］。另有研究比較了受精卵母細(xì)胞和未受精卵母細(xì)胞對應(yīng)的卵泡液多肽譜，發(fā)現(xiàn)在未受精卵母細(xì)胞對應(yīng)的卵泡液中，硫酸乙酰肝 素 蛋 白 聚 糖（Heparan sulfate proteoglycan，HSPG）的表達(dá)明顯增高［15］，而HSPG 與HRG 已被證實在血管形成過程中存在密切的相互作用［16］。Van Montfoort等［17］用全基因組掃描技術(shù)，比較了卵裂和未能早期卵裂的受精卵所對應(yīng)的顆粒細(xì)胞基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞凋亡、FGF 信號通路、細(xì)胞因子信號通路、趨化因子信號通路有關(guān)的基因在兩組間存在表達(dá)差異，而HRG 蛋白廣泛參與了以上各過程和通路。HRG C633T 多態(tài)性可能通過上訴途徑影響了卵巢反應(yīng)性甚至卵母細(xì)胞質(zhì)量及后續(xù)受精卵發(fā)育。

本研究的最大局限在于樣本量不足，遠(yuǎn)小于理論所需最小樣本量，但本研究嚴(yán)格篩選納入人群，控制單一變量，一定程度上保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。此外，本研究考慮到對妊娠率影響的多因素混雜，如新鮮移植周期／冷凍移植周期、移植前長降調(diào)、納入患者廣泛存在子宮內(nèi)膜息肉、子宮肌瘤、子宮腺肌癥等情況，因此未能探索不同基因型對著妊娠結(jié)局（著床率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率及抱嬰率）的影響。后續(xù)研究可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)，深入驗證本研究結(jié)果，進(jìn)一步討論該基因型對種植率、妊娠率、流產(chǎn)率等的影響，并可結(jié)合VEGF等相關(guān)因子的基因多態(tài)性行多因素回歸分析，為個體化制定治療方案提供更可靠的證據(jù)。

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