改良超長方案改善卵巢低反應患者IVF／ICSI妊娠結局：一項自身對照研究

李元，羅克莉1，，唐奕1，，張紅，龔斐1，＊

（1.湖南中南大學生殖與干細胞研究所，長沙 410083；2.湖南中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院，長沙 410000）

目前體外受精-胚胎移植（IVF-ET）助孕的妊娠率明顯改善，大約穩(wěn)定在40%～60%，但在控制性卵巢刺激（COS）過程中卵巢低反應（poor ovarian response，POR）的 發(fā) 生 率 仍 然 很 高，約9% ～24%［1］。POR 是在輔助生殖助孕過程中卵巢對外源性促性腺激素（gonadotropin，Gn）刺激反應不佳的一種病理狀態(tài)。對于卵巢低反應者由于卵巢儲備下降，竇卵泡減少，促性腺激素峰平抑因子（gonadotropin sugre-attenuating factor，GnsAF）活性降低，不能控制黃體生成素（luteinizing hormone，LH）的分泌［2］，更易發(fā)生早發(fā)的LH 峰而增加周期取消率［3-4］，降低臨床妊娠率。因此，對于預測可能發(fā)生POR 的患者如何采取有效的促排卵方案以降低周期取消率，提高卵巢的反應性和妊娠率，至今仍是輔助生殖技術（ART）過程中的一大難題。

促性腺激素釋放激素拮抗劑（Gonadotropin-releasing hormone antagonist，GnRH-ant）是一種促性腺激素釋放激素（GnRH）類似物［5］，它與垂體的GnRH 受體競爭性結合達到快速抑制內源性GnRH對垂體的興奮作用，但不具有刺激Gn釋放的功能，不存在“一過性升高”（“Flare up”）效應。正是由于拮抗劑方案的種種優(yōu)勢，目前GnRH-ant在POR 患者中應用廣泛，能有效地減少Gn總量，但是對IVF鮮胚周期控制早發(fā)的LH 峰、子宮內膜容受性及對妊娠結局的影響尚無統(tǒng)一意見［6-7］。同時有學者認為拮抗劑方案COS 過程中會出現(xiàn)卵泡發(fā)育不同步［8］，而未對拮抗劑前一月經周期黃體-卵泡轉換期上升的卵泡刺激素（FSH）進行抑制，該FSH 的上升使得一些本身對FSH 敏感的卵泡優(yōu)先發(fā)育而增加卵泡發(fā)育不同步率。而在ART 中促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-a）的引入，垂體脫敏而能有效地抑制95%～98%早發(fā)的內源性黃體生成素（LH）上升的發(fā)生［9］。在使用GnRH-a垂體脫敏控制性 超 排 卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）中卵泡過早黃素化發(fā)生率仍有5% ～30%［10-13］。在POR 者 尤 甚［9］。然 而，對 于POR 者我院采用的改良超長方案在長方案的基礎上再次給予1／3～1／2 量的GnRH-a降調節(jié)，能有效地抑制早發(fā)的LH 峰、提高卵泡發(fā)育同步性、并增加子宮內膜容受性。因此，本文旨在對POR 患者進行自身對照，探討應用拮抗劑方案助孕失敗后采用改良超長方案對妊娠結局有否改善作用。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2013年1月至2015年2月，63例POR 患者在我院生殖中心接受IVF／ICSI助孕治療，行拮抗劑方案助孕未孕改行改良超長方案助孕的自身對照。入選指標：基礎FSH≥12U／L，獲卵數(shù)≤5枚。剔除指標：符合如下圖1 中的指標任1條則不入選該研究。

圖1 研究對象剔除標準

二、方法

拮抗劑方案（A 組）：于月經第2天（D2）常規(guī)抽血查基礎內分泌激素［E2、FSH、LH、孕酮（P）等］和陰道B 超：如子宮內膜厚度（Em）≤8 mm，卵泡直徑≤10mm，雙側卵巢未見黃體囊腫，E2＜293pmol／L，P＜3.2nmol／L，F(xiàn)SH ≤15 U／L，則 月 經 第3 天（D3）開始使用促性腺激素（Gn），如重組FSH（rFSH，默克雪蘭諾，德國）、人絕經期促性腺激素（HMG，麗珠醫(yī)藥，75IU／支）約225～300IU／d，每1～3d復查B超和抽血查激素水平（E2、FSH、LH、P等），根據(jù)卵泡反應性調整Gn用量，當最大卵泡直徑達12 mm 時加用拮抗劑（Cetrotide，默克雪蘭諾，德國）劑量0.25mg／d，直至注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）日。

改良超長方案（B 組）：在前一月經周期黃體中期首次注射GnRH-a 1.5mg后30d再次注射相同劑量GnRH-a，末次注射后13～20d抽血查基礎內分泌激素（E2、FSH、LH、P 等）和陰道超聲檢查，如E2＜146.4pmol／L、P＜2.5nmol／L、LH＜3 U／L，B超示Em＜5mm，沒有直徑＞10mm 的卵泡時視為達到降調節(jié)標準。即開始使用HMG 肌肉注射超排卵。根據(jù)卵泡反應性調整Gn用量。

兩種方案處理的患者注射HCG 時間、取卵時間、技術、卵母細胞和胚胎培養(yǎng)、IVF、ICSI、輔助孵化和胚胎移植（ET）按照我中心標準操作［14］。

三、統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件包對參數(shù)進行分析。正態(tài)分布計量資料均數(shù)±標準差（±s）表示，均數(shù)的比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料用率（%）表示，并采用卡方檢驗。P＜0.05具有統(tǒng)計學差異。

結 果

一、兩組患者一般臨床資料比較

兩組患者基本資料無明顯差異，但改良超長方案組（B 組）Gn 天 數(shù) 和Gn 劑 量 明 顯 增 加（P ＜0.001）（表1）。

二、兩組患者HCG 日激素水平和子宮內膜比較

與拮抗劑方案相比，改良超長方案組（B 組）HCG 日P（P＜0.001）、P／E2（P＝0.001）明顯降低，HCG日LH＞5U／L發(fā)生率、HCG 日LH＞10U／L發(fā)生率明顯降低（P＜0.001），子宮內膜厚度（Em）明顯增加（P＜0.01）（表2）。

三、改良超長方案組妊娠結局

改良 超 長 方 案 組（B 組）著 床 率42.86%（33／77），臨床妊娠率61.11%（22／36）；與拮抗劑組相比，改良超長方案組優(yōu)胚率［（69.63±438.89）vs.（81.76±25.87），P＝0.041］增加，平均獲卵數(shù)、受精率、取消率在兩組無顯著差異（P＝0.717），兩組均未發(fā)生異位妊娠、流產（表3）。

表1 兩組患者一般臨床資料比較（±s）

表1 兩組患者一般臨床資料比較（±s）

注：與A 組比較，＊＊P≤0.001

組 別 例數(shù) 年齡（歲） 不育年限（年） BMI（kg／m2） 基礎FSH（U／L） Gn天數(shù)（d） Gn劑量（IU）A 組 63 36.50±4.20 7.41±5.02 22.04±2.08 17.57±6.32 8.38±1.89 1 673.21±586.48 B組 63 36.87±4.24 7.87±5.15 21.81±2.31 17.38±5.84 12.70±2.74＊＊ 4 852.17±1 304.57＊＊

表2 兩組患者HCG 日激素水平和子宮內膜比較［（±s），n（%）］

表2 兩組患者HCG 日激素水平和子宮內膜比較［（±s），n（%）］

注：與A 組比較，＊P＜0.01，＊＊P≤0.001

組 別 例數(shù) HCG 日P（nmol／L）HCG 日E2（pmol／L）HCG 日P／E2 HCG 日LH（U／L）HCG 日LH＞5U／L HCG 日LH＞10U／L HCG 日Em（mm）A 組 63 1.99±1.07 3 624.6±1 337.8 0.69±0.35 6.05±5.31 27／63（42.86）14／63（22.22）10.51±2.18 B組 63 1.42±0.57＊＊4 170.2±2 014.4 0.49±0.32＊＊1.42±0.99＊＊3／63（4.76）＊＊ 0／630（0）＊＊ 12.03±2.13＊

表3 兩組患者臨床結局比較［（±s），n（%）］

表3 兩組患者臨床結局比較［（±s），n（%）］

注：與A 組比較，＊P＜0.05，＊＊P≤0.001

組 別 例數(shù) 平均獲卵數(shù)（個） 受精率 優(yōu)胚率 移植胚胎數(shù)（個）0.62 B組 63 2.73±1.58 79.82±31.10 81.76±25.87＊ 2.15±0.66組 別 例數(shù) 臨床妊娠率 著床率 取消率 流產率 宮外孕發(fā)生率A 組 63 0／38（0） 0／60（0） 25／63（39.68）A 組 63 2.69±1.58 76.59±32.49 69.63±438.89 1.57±0 0 B組 63 22／36（61.11）＊＊ 33／77（42.86）＊＊ 27／63（42.86）0 0

討 論

在ART 助孕治療過程中，獲得一定數(shù)量的成熟卵母細胞是關鍵環(huán)節(jié)，而卵巢內的卵泡自胎兒時期開始以凋亡閉鎖的方式逐漸減少，剩余卵泡池在達到臨界值時卵泡閉鎖速率顯著加快，卵巢對外源性Gn的反應性降低。自然月經中期LH 峰出現(xiàn)除與排卵前優(yōu)勢卵泡分泌的雌激素高峰正反饋相關外，還與小卵泡產生的GnsAF 降低有關。而早發(fā)LH 峰 可 能 與GnSAF 有 關［15］。GnSAF 通 過 拮 抗E2對垂體的致敏作用調節(jié)內源性LH 的分泌，控制LH 的脈沖分泌時間且對卵泡過早黃素化具有預防作用［15］。在POR 患者，卵巢儲備下降，小卵泡減少，GnSAF分泌降低，對垂體的負反饋抑制作用減弱，卵泡低E2的峰值更易正反饋誘導垂體LH 峰值的出現(xiàn)［9，16］。早發(fā)LH 峰引起過早排卵和卵泡過早黃素化，致助孕取消周期增加，妊娠率下降［16］。在我們的研究中，改良超長方案和拮抗劑方案組自身對照基本資料無明顯差異，但改良超長方案組HCG日LH 水平、HCG 日LH＞5U／L 發(fā)生率、HCG 日LH＞10U／L發(fā)生率均明顯下降（P＜0.001），明顯降低了早發(fā)LH 峰發(fā)生率。超長方案既往在子宮內膜異位癥患者中廣泛應用［17-18］。我們將通常針對子宮內膜異位癥患者的超長方案進行改良：連續(xù)兩次黃體中期注射小劑量GnRH-a（1.5mg）后，使體內LH 水平控制在一個合適的范圍，減少早發(fā)LH峰的發(fā)生。但是，由于改良超長方案對LH 水平抑制的更深使得該組患者Gn天數(shù)和Gn總藥量較拮抗劑方案組增多（P＜0.001）。

有研究報道：在COS中發(fā)生POR 時，早發(fā)LH峰發(fā)生的增加將降低臨床妊娠率［19］。COS過程中超生理劑量激素水平導致子宮內膜提前發(fā)育，移植卵裂期胚胎不利于建立胚胎-子宮內膜對話（embryo-endometrium cross-dialogue）而 不 利 于 著 床［20］。我們的數(shù)據(jù)顯示改良超長方案在降低早發(fā)LH 峰發(fā)生率的同時降低HCG 日P（P＜0.001）、P／E2（（P＝0.001）等而可能增加子宮內膜容受性。同時，既往研究提示改良超長方案可能通過免疫調理而改善子宮內膜容受性：超長方案治療中GnRH-a可能是通過增加子宮內膜分泌GnRH-1和GnRH-2而激活絨毛膜和底蛻膜細胞上調控子宮內膜間質蛋白水解的酶類，從而有利于內膜蛻膜化和胚胎著床［21-22］。亦有學者提出GnRH-a調節(jié)體液中細胞因子（如白細胞介素1、腫瘤壞死因子-α）改善生殖內環(huán)境，有利于胚胎著床［23］。GnRH-a能夠干擾子宮內膜轉化生長因子（TGF）-β受體信號轉導途徑，抑制蛻膜細胞凋亡和延長種植窗的作用，從而影響胚胎著床［24］。但相關實驗研究還需進一步證實。且目前大部分的研究顯示：當HCG 日Em＞14 mm 時，IVF周期胚胎著床率、臨床妊娠率降低，流產率增加；Em＜6～7mm 時，胚胎著床率及臨床妊娠率極低［25］。我們的數(shù)據(jù)顯示改良超長方案組HCG 日Em 增 加，即 使 優(yōu) 胚 率［（69.63±438.89）vs.（81.76±25.87），P＝0.041］下降仍能明顯改善妊娠結局，具體機理還需繼續(xù)探究。

對于POR 患者這一特殊人群，改良超長方案明顯降低早發(fā)LH 峰的發(fā)生率且可能通過改善子宮內膜容受性而改善妊娠結局。因此，對于POR 患者采用拮抗劑方案助孕失敗后，嘗試應用改良超長方案助孕也是一種很好的選擇。

［1］ Tarlatzis BC，Zepiridis L，Grimbizis G，et al.Clinical management of low ovarian response to stimulation for IVF：a systemic review［J］.Hum Reprod Update，2003，9：61-76.

［2］ Martinez F，Barrip N，Coroleu B，et al.Women with poor response to IVF have lowered circulating gonadotrophin surge-attenuating factor （GnSAF ） bioactivity during spontaneous and stimulated cycles［J］.Hum Reprod，2002，17：634-640.

［3］ Barrip N，Coroleu B，Martinez F，et al.Stimulation protocols for poor responders and aged women ［J］. Mol Cell Endocrinol，2000，166：15-20.

［4］ Ferraretti AP，Gianaroli L，Magli MC，et al.Female poor responders［J］.Mol Cell Endocrinol，2000，161（1-2）：59-66.

［5］ Olivennes F，F(xiàn)anchin R，Bouchard P，et al.Scheduled administration of a gonadotrophin-releasing hormone antagonist（Cetrorelix）on day 8of in-vitro fertilization cycles：apilot study［J］.Hum Reprod，1995，10：1382-1386.

［6］ Kolibianakis EM，Collins J，Tarlatzis BC，et al.Among patients treated for IVF with gonadotrophins and GnRH analogues，is the probability of live birth dependent on the type of analogue used？A systematic review and meta-analysis［J］.Hum Reprod Update，2006，12：651-671.

［7］ Al-Inany HG， Youssef MA， Aboulghar M，et al.Gonadotrophin-releasing hormone antagonists for assisted reproductive technology［DB］.Cochrane Database Syst Rev，2011，11（5）：CD001750.

［8］ Fanchin R，Schon?uer LM，Cunha-Filho JS，et al.Coordination of antral follicle growth：basis for innovative concepts of controlled ovarian hyperstimulation［J］.Semin Reprod Med，2005，23：354-362.

［9］ Younis JS，Matilsky M，Radin O，et al.Increased progesterone／estradiol ratio in the late follicular phase could be related to low ovarian reserve in in vitro fertilizationembryo transfer cycles with a long gonadotropin-releasing hormone agonist［J］.Fertil Steril，2001，76：294-299.

［10］ Edelstein MC，Seltman HJ，Cox BJ，et al.Progesterone levels

on the day of human chorionic gonadotropin administration in cycles with gonadotropin-releasing hormone agonist suppression are not predictive of pregnancy outcome［J］.

Fertil Steril，1990，54：853-857.

［11］ Silverberg KM，Burns WN，Olive DL，et al.Serum progesterone levels predict success of in vitro fertilizationembryo transfer in patients stimulated with leuprolide acetate and human menopausal gonadotropins［J］.J Clin Endocrinol Metab，1991，73：797-803.

［12］ Givens CR，Schriock ED，Dandekar PV，et al.Elevated serum progesterone levels on the day of human chorionic gonadotropin administration do not predict outcome in assisted reproduction cycles［J］.Fertil Steril，1994，62：1011-1017.

［13］ Yovel I，Yaron Y，Amit A，et al.High progesterone levels adversely affect embryo quality and pregnancy rates in in vitro fertilization and oocyte donation programs［J］.Fertil Steril，1995，64：128-131.

［14］ 李元，羅克莉，龔斐.地屈孕酮預處理可以增加拮抗劑方案中卵泡均勻性［J］.生殖醫(yī)學雜志，2013，22：806-810.

［15］ 葉虹.高黃體生成素水平與早發(fā)黃體生成素峰的概念［J］.生殖醫(yī)學雜志，2010，19：177-179.

［16］ Fowler PA，，Sorsa-Leslie T，Harris W，et al.Ovarian gonadotrophin surge-attenuating factor（GnSAF）：where are we after 20years of research？［J］.Reproduction，2003，126：689-699.

［17］ Surrey MD，Kaylen M，Silverberg MD，et al.Effect of prolonged gonadotropin-releasing hormone agonist therapy on the outcome of in vitro fertilization-embryo transfer in patients with endometriosis［J］.Fertil Steril，2002，78：699-704.

［18］ Rickes D，Nickel I，Kropf S.Increased pregnancy rates after ultralong postoperative therapy with gonadotropin releasing hormone analogs in patients with endometriosis［J］.Fertil Steril，2002，78：757-762.

［19］ Fanchin R，Righini C，Olivennes F，et al.Consequences of premature progesterone elevation on the outcome of in vitro fertilization：insights into a controversy［J］.Fertil Steril，1997，68：799-805.

［20］ Bourgain C，Devroey P.The endometrium in stimulated cycles for IVF［J］.Hum Reprod Update，2003，9：515-522.

［21］ Liu J，Maccalman CD，Wang YL，et al.Promotion of human trophoblasts invasion by gonadotropin-releasing hormone（GnRH）I and GnRH II via distinct signaling pathways［J］.Mol Endocrinol，2009，23：1014-1021.

［22］ Xiong M，Zhang H，Jin L，et al.Association of controlled ovarian hyperstimulation treatment with down-regulation of key regulators involved in embryonic implantation in mice［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2011，31：535-542.

［23］ Izvol’skaia MS，Sharova VS，Zakharova LA.Mechanisms of the hypothalamic-pituitary and immune system regulation：the role of gonadotropin-releasing hormone and immune mediators［J］.Izv Akad Nauk Ser Biol，2010，4：451-461.

［24］ Mabuchi Y， Yamoto M， Minami S， et al.Immunohistochemical localization of inhibin and activin subunits，activin receptors and Smads in ovarian endometriosis［J］.Int J Mol Med，2010，25：17-23.

［25］ Zhang X，Chen CH，Confino E.Increased endometrial thickness is associated with improved treatment outcome for selected patients undergoing in vitro fertilization-embryo transfer［J］.Fertil Steril，2005，83：336-340.