葛根芩連口服液體外抑菌及體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用的試驗

左春生

（河南省信陽農(nóng)林學(xué)院，河南 信陽 464000）

試驗研究葛根芩連口服液體外抑菌及體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用。選用21日齡仔豬40頭，隨機分為4組，每組10頭。Ⅰ組為對照組，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組為飲水中添加葛根芩連口服液，添加量分別為0.2，0.4，0.7 mL/L，同時采用雙倍稀釋法，測定葛根芩連口服液對大腸桿菌、沙門菌及腸球菌的藥敏試驗。結(jié)果表明，體外抑菌初步考察結(jié)果顯示，葛根芩連口服液對腸球菌、沙門菌、大腸桿菌均有抑制作用，其MIC值分別為20.83μg/mL、41.7μg/mL、62.5μg/mL，抑菌效果強于單獨的葛根、黃芩、黃連提取液及硫酸粘桿菌素。同時仔豬血清中IL-1、IL-4、TNF-α、TNF-γ細胞因子水平有不同程度的提高（P＜0.05）。結(jié)果提示，葛根芩連口服液能提高仔豬血清中細胞因子水平及機體免疫功能，并且對大腸桿菌、沙門菌、腸球菌具有良好體外抑菌作用。

葛根芩連口服液；體外抑菌；免疫調(diào)節(jié)

仔豬腹瀉是集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)條件下的一種典型的多因素性疾病，是目前最嚴重的仔豬疾病之一，也是引起仔豬死亡的重要原因，據(jù)調(diào)查，仔豬因腹瀉死亡占仔豬死亡總數(shù)的39.8%。體重30 kg以下的仔豬，全年平均發(fā)病率46.5%，死亡率10.3%[1]。仔豬腹瀉在養(yǎng)豬業(yè)危害中居首位，嚴重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，導(dǎo)致飼料報酬率較低、仔豬存活率下降、生長緩慢、生長發(fā)育停滯，甚至死亡。由于引起本病發(fā)生的病因復(fù)雜，常表現(xiàn)為多種因素相互作用的結(jié)果，導(dǎo)致臨床診斷與防治困難。因此，如何采取有效的措施預(yù)防和控制仔豬腹瀉、提高仔豬存活率已成為養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)的一項重要課題。

葛根芩連制劑來源于《傷寒論》中葛根黃芩黃連湯，稱葛根黃芩黃連湯證。本方以葛根為主，其性辛涼，輕清外發(fā)，既可解肌表之邪熱，又能升脾胃清陽，起陰氣而止下痢;芩連苦寒，善清里熱，而厚腸胃，從而表解里和，身熱可退，下痢可止;甘草和中益氣，調(diào)和諸藥。四藥共奏外解表邪，內(nèi)清里熱，故稱表里雙解之劑[2]。是治療濕熱下痢、細菌腹瀉等大腸濕熱證的常用中藥制劑[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，葛根、黃芩、黃連均具有較好的抗菌、抗炎、抗氧化作用，此外葛根還具有免疫增強作用，能明顯的增強小鼠巨噬細胞的吞噬功能。目前葛根芩連制劑對仔豬腹瀉的影響研究主要表現(xiàn)體外抑菌等單個指標(biāo)的研究，忽視機體免疫功能及各個指標(biāo)相互關(guān)系，本試驗根研究葛根芩連制劑體外抑菌和體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用，對應(yīng)分析其相互關(guān)系，為規(guī)?；?、科學(xué)化、無抗化養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品 葛根芩連口服液由信陽農(nóng)林學(xué)院藥理實驗室自制，該制劑每毫升相當(dāng)于生藥3 g，口服液中葛根素、黃芩苷、鹽酸小檗堿的濃度分別為4.0 mg/mL、4.5 mg/mL和7.5 mg/mL。有效成分的總濃度為15 mg/mL。對照品為葛根、黃芩和黃連提取液，有效成分含量分別為7、10 mg/和10 mg/mL。

1.2 試驗菌株 標(biāo)準菌株：腸球菌ATCC51299、大腸埃希菌ATCC25922，沙門菌C79-13，購自南京便珍生物科技有限公司；臨床分離菌株：腸球菌3株（LEl～LE3）、大腸埃希菌5株（EI～E5）、沙門菌5株（Sl～S5），由信陽農(nóng)林學(xué)院微生物實驗室保存提供。

1.3 試劑 營養(yǎng)瓊脂、肉湯培養(yǎng)基，購自杭州天和微生物試劑有限公司；豬IL-1、IL-4、TNF-α、TNF-γ試劑盒，購自美國ADL公司；其他化學(xué)試劑，購自上海國藥集團。

1.4 試驗動物 選取21日齡健康“杜×長×大”三元健康雜交仔豬40頭，試驗設(shè)4個處理組，每個處理組10頭仔豬，試驗從21 d開始，預(yù)試期為7 d；28 d進入正試期，試驗中動物采用飲水給藥，連用7 d。I組為對照組，飲水中不添加任何藥物，Ⅱ組在飲水中添加葛根芩連口服液0.2 mL/L，相當(dāng)于原藥材的0.6 g/kg；III組為飲水中添加葛根芩連口服液0.4 mL/L，相當(dāng)于原藥材的1.2 g/kg；Ⅳ組為飲水中添加葛根芩連口服液0.7 mL/L，相當(dāng)于原藥材的2.1 g/kg

1.5 試驗方法

1.5.1 體外抑菌試驗 參考文獻[4]進行試驗研究，培養(yǎng)上述3種細菌，用生理鹽水將菌苔洗下，稀釋成105CFU/mL的菌液備用，取無菌試管10支，第1管加1.8 mL營養(yǎng)肉湯，第2管至第10管加1 mL營養(yǎng)肉湯，以無菌操作吸取已制備好的供試藥液0.2 mL加入第1管，混合均勻后吸取1 mL加入第2管中，依次倍比稀釋至第9管，棄去1 mL，第10管作為對照，每管加如0.1 mL菌液，試管放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察最小抑菌濃度，并與葛根、黃芩、黃連提取液及硫酸粘桿菌素進行對比。

1.5.2 免疫指標(biāo)的測定 分別在給藥后5、10、15 d每組隨機抽取4頭仔豬，前腔靜脈采血，分離血清，進行IL-1、IL-4、TNF-α、TNF-γ細胞因子的檢測，方法按試劑盒說明書進行。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理 試驗數(shù)據(jù)采用SAS 8.0軟件單因素方差分析進行統(tǒng)計分析，若經(jīng)F檢驗差異顯著者再用LSD法進行多重比較，試驗結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準差示。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根芩連口服液對標(biāo)準菌株最小抑菌濃度

葛根芩連口服液對標(biāo)準菌株的最小抑菌濃度見表1，從表1可知，葛根芩連口服液對腸球菌、沙門菌和大腸桿菌有較好的抑菌作用。以有效成分總的含量計，其MIC值分別為腸球菌16μg/mL；沙門菌31.25μg/mL；大腸桿菌31.25μg/mL，且其抑菌效果優(yōu)于葛根、黃芩、黃連單味藥的抑菌效果，其對大腸桿菌的抑菌濃度要差于硫酸粘桿菌素（P＜0.05），但對腸球菌效果要優(yōu)于粘桿菌素（P＜0.05）。

2.2 葛根芩連口服液對臨床分離菌株平均最小抑菌濃度 葛根芩連口服液對臨床分離菌株平均最小抑菌濃度見表2，從表2可知，葛根芩連注射劑對腸球菌、沙門菌和大腸桿菌在體外均有一定的抑制作用，其抑菌作用比單獨的葛根、黃芩、黃連提取液強，其MIC值分別為腸球菌20.83μg/mL；沙門菌41.7μg/mL；大腸桿菌62.5μg/mL。和硫酸粘桿菌素相比，對腸球菌、沙門菌和大腸桿菌效果較好，差異顯著（P＜0.05）。

表1 葛根芩連口服液對標(biāo)準菌株的最小抑菌濃度（μg/mL）

表2 葛根芩連口服液對臨床分離菌株平均最小抑菌濃度（μg/mL）

2.3 葛根芩連口服液對仔豬體內(nèi)細胞因子含量的影響 由表3可知，葛根芩連口服液能夠促進仔豬脾臟淋巴細胞產(chǎn)生IL-1、IL-4、TNF-α、TNF-γ細胞因子。在給藥5 d后，血清中IL-1水平Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組與I組比較差異不顯著（P＞0.05）。IL-4水平Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組與I組比較差異不顯著（P＞0.05）。給藥15 d后，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組血清中IL-1、IL-4I水平與I組比較差異顯著（P＜0.05），其中Ⅲ組血清中IL-1、IL-4I水平最高。在給藥5 d、15 d后，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組血清中TNF-α與I組比較差異顯著（P＜0.05）。給藥10d、15d后Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組與I組比較差異均顯著（P＜0.05）。此外，由表3可知，試驗Ⅲ組與Ⅱ、Ⅳ組比較差異顯著（P＜0.05）。

表3 葛根芩連口服液對仔豬細胞因子的影響

3 討論

疾病的發(fā)生不外乎兩種條件：正氣與邪氣。養(yǎng)自身正氣以對抗外來邪氣，就可以避免疾病的發(fā)生，正可謂“正氣存內(nèi)，邪不可干”，提高自身免疫力，避免外邪（細菌等）致病[5]。仔豬腹瀉是目前最嚴重的仔豬疾病群之一，70%～80%由細菌、病毒感染引起，以腸球菌、大腸桿菌為多見，其次為輪狀病毒等[6]。本試驗體外抑菌試驗顯示，葛根芩連口服液對大腸桿菌、沙門菌、腸球菌可有不同程度的抑菌效果，其抑菌作用比單獨的葛根、黃芩、黃連提取液強；可能有效成分的綜合作用導(dǎo)致口服液抑菌作用的增強。

細胞因子是免疫細胞（單核、巨噬細胞、T細胞、B細胞、NK細胞等）和某些非免疫細胞（如血管內(nèi)皮細胞、表皮細胞、纖維母細胞等）合成分泌的一類生物活性蛋白[7]。T細胞在機體免疫系統(tǒng)具有非常重要的作用，參與促進細胞免疫應(yīng)答和促進體液免疫。因此IL-1、IL-4、TNF-α、TNF-γ等細胞因子在抗病毒感染和抗菌性炎癥反應(yīng)有著極其重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，葛根素具有免疫增強作用，能明顯的增強小鼠巨噬細胞的吞噬功能[8]。本試驗研究表明葛根芩連口服液對仔豬血清中細胞因子的含量具有增強的作用，綜上所述，葛根芩連口服液可以增強細胞免疫功能，并且對大腸桿菌、沙門菌、腸球菌具有良好體外抑菌作用。

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