超聲波輔助提取大球蓋菇總黃酮工藝優(yōu)化

陳嬋，黃靖，丁玲（福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建福州350119）

超聲波輔助提取大球蓋菇總黃酮工藝優(yōu)化

陳嬋，黃靖，丁玲（福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建福州350119）

摘要：主要研究了超聲波輔助提取大球蓋菇中總黃酮的提取工藝，研究了乙醇濃度、超聲功率、時(shí)間、料液比對(duì)大球蓋菇總黃酮提取率的影響。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了大球蓋菇黃酮類化合物的優(yōu)化提取工藝條件。超聲波優(yōu)化提取工藝條件為：乙醇濃度30%，料液比1∶15（g/mL），超聲功率120 W，時(shí)間1 h，總黃酮的提取率為1.138%。

關(guān)鍵詞：大球蓋菇；總黃酮；超聲波輔助提取

大球蓋菇（Stropharia rugoso-annulata Farlow）別名皺環(huán)球蓋菇、皺球蓋菇、酒紅大球蓋菇、裴氏球蓋菇、裴氏假黑傘，是歐美各國(guó)人工栽培的著名食用菌之一，也是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）向發(fā)展中國(guó)家推薦栽培的食用菌之一。大球蓋菇栽培原料來(lái)源豐富，技術(shù)簡(jiǎn)單，產(chǎn)量高，成本低，經(jīng)濟(jì)效益可觀，在廣大農(nóng)村極易推廣[1]。大球蓋菇菇味清香、肉質(zhì)脆嫩、適口性好、產(chǎn)量高，其子實(shí)體中富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和多糖等營(yíng)養(yǎng)成分[2]。

黃酮類化合物是存在于自然界的一大類的化合物，是一種對(duì)人體非常有用的活性物質(zhì)，是許多藥品和保健品的主要成分，它具有殺蟲、抗病毒、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)和祛痰的生理活性。黃酮化合物提取一般采用水、酸、或堿和有機(jī)溶劑對(duì)植物進(jìn)行浸提，但細(xì)胞壁中的纖維組織會(huì)像一個(gè)天然屏障阻礙有效物質(zhì)的提取的，且往往耗時(shí)費(fèi)藥。陳君琛[3]等研究了大球蓋菇黃酮類化合物提取及抑菌性研究，結(jié)果表明：乙醇體積分?jǐn)?shù)95%，料液比為1∶90（g/mL），溫度60℃，時(shí)間120 min，提取率為0.794%。超聲波具有很大的能量，它的強(qiáng)烈攪拌、振動(dòng)、空化作用可以破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加速有效物質(zhì)的溶出，不僅可以提高提取效率，而且可以大大縮短時(shí)間，節(jié)省能源。本文采用超聲波輔助強(qiáng)化提取大球蓋菇總黃酮的含量，避免提取時(shí)間長(zhǎng)，提取不完全的缺點(diǎn)，同時(shí)也提高了提取的效率，研究超聲波輔助提取工藝的最佳路線。該研究成果對(duì)為大球蓋菇的總黃酮的提取路線提供參考，同時(shí)為大球蓋菇的綜合開發(fā)利用提供參考。

1　材料、儀器與方法

1.1材料與試劑

大球蓋菇：產(chǎn)自福建省將樂(lè)縣。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（Aladdin chemistry co.Ltd蕓香葉苷，分析標(biāo)準(zhǔn)品，≧98%）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇等所用試劑均為分析純。

1.2主要儀器

722s可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；101-2型鼓風(fēng)干燥箱：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；KQ-300VDE超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；BS224S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1大球蓋菇黃酮類化合物提取工藝流程

大球蓋菇→50℃烘干→粉碎→過(guò)60目篩→一定量的大球蓋菇加一定溶劑超聲波輔助提取→離心→檢測(cè)。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[4]

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，以60%的乙醇定容至5 mL，再加蒸餾水稀釋至10 mL。得到濃度為1.0 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL蘆丁溶液于10 mL具塞刻度試管中，先加5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻放置6 min后，加入10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻放置6 min，最后加1 mol/mL NaOH溶液4.0 mL，用60%乙醇定容至刻度，搖勻后放置15 min，在510 nm下測(cè)定吸光度，以蘆丁含量為0的處理為空白對(duì)照，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3樣品中總黃酮提取的測(cè)定及計(jì)算

稱取1 g的干燥樣品，用一定溶度的乙醇溶液以一定的料液比在一定功率下超聲波輔助提取一定時(shí)間，離心過(guò)濾，定容。取上清液0.3 mL，放入具塞刻度試管中，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻放置6 min后，加入10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻放置6 min后，加1 mol/mL NaOH溶液4.0 mL，用60%乙醇定容至刻度，搖勻后放置15 min，以蘆丁含量為0的處理為空白對(duì)照，在510 nm下測(cè)定吸光度，并算出其總黃酮提取率。

總黃酮的提取率/%=提取總黃酮質(zhì)量/原料的質(zhì)量×100

1.3.4單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)

乙醇溶度采用10%、30%、50%、70%、90%5個(gè)水平；料液比（干粉質(zhì)量∶溶劑，g/mL）采用1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 4個(gè)水平；浸提時(shí)間采用0.5、1、1.5、2、2.5 h 5個(gè)水平；浸提功率120、180、240、300 W 4個(gè)水平分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定正交試驗(yàn)因素，選取L9（34）正交表做正交試驗(yàn)，得出超聲波輔助強(qiáng)化提取大球蓋菇總黃酮的最佳工藝參數(shù)。

1.3.5驗(yàn)證試驗(yàn)及精密度試驗(yàn)[5-6]

準(zhǔn)確稱取1 g大球蓋菇粉末5份，以正交試驗(yàn)得出的最佳提取工藝進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，分別按照1.3.3中的方法進(jìn)行總黃酮含量的測(cè)定。

以正交試驗(yàn)得出的最佳提取工藝進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，然后分別準(zhǔn)確量取2.00 mL待測(cè)液于5個(gè)10 mL比色管中，分別按照1.3.3的方法進(jìn)行總黃酮含量的測(cè)定。

1.3.6加標(biāo)回收率[7]

準(zhǔn)確移取已知總黃酮質(zhì)量濃度的樣品溶液0.50 mL，平行5份，分別置于25 mL比色管中，再分別準(zhǔn)確加入 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2 mg/mL）。按1.3.2方法得總黃酮質(zhì)量濃度。

加標(biāo)回收率/%=（加標(biāo)試樣測(cè)定值-試樣測(cè)定值）÷加標(biāo)量×100

1.3.7數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1總黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取蘆丁，配制得到濃度為1.0 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。根據(jù)方法1.3.2進(jìn)行數(shù)據(jù)回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線（蘆丁濃度Y和吸光值A(chǔ)的關(guān)系）。其回歸方程：Y（mg/mL）= 1.114 3X+0.004 8，R2=0.999 8。

2.2乙醇濃度對(duì)大球蓋菇總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取大球蓋菇干樣1 g，分別選用10%、30%、50%、70%、90%5個(gè)乙醇濃度，在超聲功率為300 W，料液比為1∶10（g/mL）的條件下提取1 h，考察乙醇濃度對(duì)大球蓋菇總黃酮提取率的影響見圖1。

圖1　乙醇濃度對(duì)大球蓋菇總黃酮提取率的影響Fig.1　Effects of alcohol concentrati on extraction rate of flavonoids

圖1表明：大球蓋菇總黃酮的提取率隨著乙醇溶度的增加先增加后減少，當(dāng)乙醇濃度為30%時(shí)大球蓋菇總黃酮的提取率最大，提取率達(dá)到0.667%。原因可能在于：高濃度的乙醇溶液使得一些醇溶性雜質(zhì)、色素、強(qiáng)親脂性成分溶出量增加，雜質(zhì)與黃酮類化合物競(jìng)爭(zhēng)與乙醇-水分子溶液體系結(jié)合，導(dǎo)致提取率下降。

2.3提取時(shí)間對(duì)大球蓋菇總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取大球蓋菇干樣各1g，在乙醇濃度為30%，料液比為1∶10（g/mL），功率300 W分別提取0.5、1、1.5、2、2.5 h，考察提取時(shí)間對(duì)大球蓋菇總黃酮提取率的影響。此外，本文采用連續(xù)超聲波輔助提取，不調(diào)整溫度的情況下，考察了在超聲波輔助提取大球蓋菇總黃酮過(guò)程中，浸提溫度的變化情況，結(jié)果見表1。

結(jié)果表明：隨著超聲波輔助強(qiáng)化提取時(shí)間的延長(zhǎng)，浸提溫度也隨之增加，當(dāng)提取時(shí)間為1 h時(shí)，溫度從室溫上升至45℃，提取2.5 h后溫度上升至68℃，而大球蓋菇總黃酮提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后下降，提取時(shí)間為1h時(shí)，提取率最高達(dá)到0.775%，原因可能在于在用超聲波輔助強(qiáng)化提取大球蓋菇總黃酮過(guò)程中，提取液的溫度不斷上升，提取時(shí)間過(guò)短時(shí)，總黃酮物質(zhì)未充分溶出，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，一方面由于浸提溫度的上升，長(zhǎng)時(shí)間的超聲波反而造成總黃酮的降解，另一方面，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，其他的物質(zhì)也隨之浸提出來(lái)，造成總黃酮提取率的下降。

表1　超聲波輔助強(qiáng)化提取大球蓋菇總黃酮過(guò)程中溫度的變化情況Table 1　The temperature change on extraction process of total flavonoids from ultrasound extraction

圖2　不同時(shí)間對(duì)大球蓋菇總黃酮提取率的影響Fig.2　Effects of supersonic time on extraction rate of flavonoids

2.4料液比對(duì)大球蓋菇總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確的稱取1 g的大球蓋菇干樣，分別選用料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20（g/mL）在超聲功率為300 W，乙醇濃度為30%條件下提取1 h，考察料液比對(duì)大球蓋菇總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3　料液比對(duì)大球蓋菇總黃酮提取率的影響Fig.3　Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of flavonoids

圖3表明：大球蓋菇總黃酮提取率隨著料液比的增加先增后減，料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，總黃酮的提取率最高，隨之提取率下降。

2.5超聲功率對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1 g大球蓋菇干樣，分別選用超聲功率為120、180、240、300 W時(shí)，在料液比為1∶10（g/mL），乙醇濃度為30%提取1 h，考察超聲功率對(duì)大球蓋菇總黃酮提取率的影響。

圖4　超聲功率對(duì)大球蓋菇總黃酮提取率的影響Fig.4　Effects of supersonic power on extracti on rate of flavonoids

圖4表明：在超聲功率為120 W時(shí)，有利于黃酮類化合物的滲透和溶解，而超聲功率越大提取率降低，可能原因在于：超聲功率大可能破壞黃酮類物質(zhì)，或超聲功率較大時(shí)導(dǎo)致其它物質(zhì)析出，雜質(zhì)溶出量增加。且實(shí)際提取過(guò)程中考慮到超聲波儀器使用壽命和節(jié)省電能，低功率可以更好的延長(zhǎng)超聲波使用壽命。

2.6正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，確定以乙醇濃度、超聲功率、料液比3種因素進(jìn)行L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，以干燥后的大球蓋菇為試樣，提取時(shí)間為1 h，以總黃酮提取率為考察對(duì)象，從而得到大球蓋菇最佳提取條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析如表2所示。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2　The results of orthogonal experiment

為判斷上述3種受控制的因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，將正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3所示。

表3　正交設(shè)計(jì)方差分析表Table 3　The table of variance analysis of orthogonal experiment

結(jié)果表明：乙醇濃度、超聲波功率顯著水平均小于0.05都有明顯顯著性，料液比顯著水平（P>0.05）無(wú)明顯顯著性。有關(guān)D水平的影響因素也在顯著的水平，在超聲波輔助強(qiáng)化提取的過(guò)程中，提取液的溫度也隨之上升，因此，D水平的影響因素極有可能為超聲過(guò)程的溫度影響或?yàn)槌暡ǖ奶崛r(shí)間，可以進(jìn)一步研究討論。超聲波強(qiáng)化提取大球蓋菇總黃酮的最佳提取工藝條件為A2B1C3D1，即乙醇濃度為30%，超聲功率為120 W，料液比1∶15（g/mL）的條件下提取1 h。

2.7驗(yàn)證試驗(yàn)及精密度

按照選定的條件A2B1C3D1進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，取平均值，驗(yàn)證了正交試驗(yàn)的結(jié)果。得到此條件下的提取率為1.138%，RSD值為0.82%，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。表明超聲波輔助提取大球蓋菇總黃酮工藝可靠，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小、所得數(shù)據(jù)精確，工藝穩(wěn)定可行。

2.8加標(biāo)回收率

根據(jù)1.3.6的方法，測(cè)定加標(biāo)回收率，結(jié)果（見表4）計(jì)算平均回收率為96.0%，RSD=0.73%（n=5），說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度好、結(jié)果可靠，用此工藝提取大球蓋菇總黃酮是可取的。

3　結(jié)論

與傳統(tǒng)的浸提法相比，超聲波輔助提取大球蓋菇總黃酮可有效的縮短提取時(shí)間，提取功率，是一種行之有效的提取手段。通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，得到了超聲波輔助提取大球蓋菇總黃酮的最佳工藝條件：在乙醇濃度為30%，超聲功率為120 W，料液比1∶15（g/mL），時(shí)間1 h，提取率為1.138%。表明大球蓋菇中含豐富的總黃酮。

對(duì)正交試驗(yàn)選定的條件進(jìn)行驗(yàn)證，表明本文所述方法提取的總黃酮結(jié)果穩(wěn)定，試驗(yàn)重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠。精密度試驗(yàn)及加標(biāo)回收試驗(yàn)法測(cè)得的結(jié)果表明，用紫外分光光度法測(cè)定大球蓋菇中總黃酮含量的準(zhǔn)確度高。

表4　回收率試驗(yàn)Table 4　The experiment of recovery rates

參考文獻(xiàn)：

[1]薩仁圖雅,圖力古爾．大球蓋菇研究進(jìn)展[J]．食用菌學(xué)報(bào),2005,12 (4):57-64

[2]張時(shí),李萍,汪尚法．大球蓋菇的采后加工[J]．山東蔬菜,2010(1): 43-44

[3] 陳君琛,李怡彬,吳俐,等．大球蓋菇黃酮類化合物提取及抑菌性研究[J]．北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010,28(6):9-13

[4]張志良,瞿偉菁,李小方．植物生理學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)[M]．北京:高等教育出版社,2009:51-54

[5]劉毅君,曾廣燁,李愛(ài)貞．超聲波輔助法提取紫蘇葉總黃酮的研究[J]．集美大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2014,19(1):20-24

[6]翟碩莉．超聲波法輔助提取香蕉皮中黃酮的工藝研究[J]．食品研究與開發(fā),2014,35(4):33-35

[7] 王寧,李遠(yuǎn)志,徐莉珍,等．超聲波法提取柿子葉總黃酮工藝的研究[J]．現(xiàn)代食品科技,2008,24(7):687-690

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.030

收稿日期：2015-02-03

作者簡(jiǎn)介：陳嬋（1980—），女（漢），講師，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。

Study on Ultrasonic Wave Assisted Extraction of Flavonoids from Stropharia

CHEN Chan，HUANG Jing，DING Ling
（Fujian Vocational College of Agriculture，F(xiàn)uzhou 350119，F(xiàn)ujian，China）

Abstract：The research aimed to study the extraction of total flavonoids from Stropharia with ultrasonic wave treatment．Based on the effect of different factors such as ethanol concentration，ultrasonic wave treatment，ultrasonic time and ratio of material to liquid，On the basis of single-factor experiments，the optimum extraction technology was determined through orthogonal experiments.30%ethanol as extracting agent，ratio of material to liquid of 1∶15 g/mL，processing 120 W with ultrasonic wave and extraction for 1 h．The optimized method is effici-ent，and the extraction yield of total flavonoids reached up to 1.138%。

Key words：Stropharia；flavonoids；ultrasound wave assisted extraction