酶解條件對豬骨漿水解物還原能力及水解度的影響

張立娟，王麒琳，溫祿云，王玥瑋，張斌，任亞妮（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

酶解條件對豬骨漿水解物還原能力及水解度的影響

張立娟，王麒琳，溫祿云，王玥瑋，張斌，任亞妮
（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

摘要：研究不同的酶解條件對豬骨漿水解物抗氧化能力和水解度的影響。將豬骨用碎骨機(jī)和骨泥機(jī)制成骨漿，用堿性蛋白酶水解，測定不同底物濃度、酶添加量、pH、溫度等條件下豬骨漿水解物的亞鐵還原能力和水解度。經(jīng)過單因素試驗(yàn)最終確定堿性蛋白酶水解豬骨漿的最佳酶解條件為：底物濃度30%、加酶量1.5%、溫度55℃、pH9.0、水解時間3 h。在此條件下得到的豬骨漿水解物的FRAP值為625 μmol/L，水解度為8.6%。

關(guān)鍵詞：酶解條件；豬骨漿水解物；亞鐵還原能力；水解度

豬骨是屠宰加工業(yè)中一種非常重要的副產(chǎn)物，約占胴體重的10%～15%[1]。豬骨中含有多種人體需要的營養(yǎng)物，含有較高的蛋白質(zhì)和磷脂質(zhì)、磷蛋白和各種氨基酸，還含有多種礦物質(zhì)，如鈣、磷、鐵及B族維生素等，而且鈣和磷的比值近似2∶1，是人體吸收鈣磷的最佳比例[2]，特別有利于人體吸收。豬骨含有構(gòu)成蛋白質(zhì)的所有氨基酸，且氨基酸比例均衡，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白[3]。豬骨蛋白的主要成分為膠原蛋白[4]，膠原蛋白是大分子蛋白質(zhì)，并不能被人體直接吸收。膠原蛋白通過酶解生成游離氨基酸、小肽等，利于腸道吸收，膠原蛋白水解液具有加強(qiáng)皮下細(xì)胞代謝、防止老化、美容等生理效果[5]，具有抗衰老、抗氧化、抗高血壓、預(yù)防與治療骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松、治療胃潰瘍等疾病的生理功能[6]。因此豬骨資源是一個有待開發(fā)的豐富的營養(yǎng)寶庫。

本研究以豬骨為研究對象，采用酶法對其進(jìn)行水解，以獲取較強(qiáng)抗氧化肽段為研究目標(biāo)，考察不同的酶解條件對亞鐵還原能力和水解度兩個指標(biāo)的影響，以期為酶法生產(chǎn)豬骨蛋白抗氧化肽提供新的技術(shù)參考。

1　材料與方法

1.1材料與主要試劑

豬骨：由天津市肉類聯(lián)合加工廠提供；堿性蛋白酶（酶活力為8 000 U/g）：諾維信公司（中國）；三吡啶三吖嗪[2，4，6-Tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]：Sigma公司；FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、氫氧化鈉、醋酸等試劑為分析純。

1.2設(shè)備與主要儀器

PG-300碎骨機(jī)、GN-80骨泥機(jī)：廊坊利杰食品機(jī)械有限公司；UV-5800PC紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市精達(dá)儀器制造有限公司；PHS-3C型pH計：上海雷磁儀器廠；天平等。

1.3方法

1.3.1豬骨漿的制備

剔除新鮮豬腿骨上的肉、皮、骨膜等非骨物質(zhì)，放入溫度低于-18℃的冰柜中進(jìn)行冷凍。冷凍時間24 h以上至豬骨完全凍透。將凍透的大骨放入碎骨機(jī)中進(jìn)行粉碎，粉碎成骨碎片。將骨碎片用自來水反復(fù)洗滌以除去骨髓及雜質(zhì)，重復(fù)幾次，而后將處理后的骨碎片骨與水按1∶1（質(zhì)量比）投入到骨泥機(jī)中進(jìn)行粗磨，收集粗磨后的骨泥再次投入到骨泥機(jī)中進(jìn)行精磨，將豬骨磨成細(xì)度100目以上的骨漿，備用。

1.3.2豬骨漿成分分析

水分含量測定方法：GB 5009.3-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》；蛋白質(zhì)含量測定方法：GB 5009.5-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》；灰分含量測定方法：GB 5009.4-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定》；脂肪含量測定方法：GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測定》。

1.3.3豬骨漿的酶解

將豬骨漿置于酶解反應(yīng)罐中，考察底物濃度、酶添加量、pH、溫度及反應(yīng)時間5個因素對亞鐵還原能力和水解度的影響。酶解過程中以0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至酶解最佳pH，記錄NaOH溶液的用量。前期試驗(yàn)確定酶解豬骨漿的最佳酶種類為堿性蛋白酶。

1.3.4水解度的測定

蛋白質(zhì)的水解度是指蛋白質(zhì)在水解過程中被裂解的肽鍵占蛋白質(zhì)總肽鍵的百分?jǐn)?shù)[7]。

水解度的測定采用pH-Stat法[5]。水解度的計算按下式計算：

式中：h為單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中被水解的肽鍵的量，mmol/g；htot為單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中肽鍵的總量，mmol/g，骨蛋白htot=11.1 mmol/g；B為水解過程中所消耗的堿液體積，mL；Nb為堿液的摩爾濃度，mol/L；1/α為校正系數(shù)（堿性蛋白酶的1/α為1.01）；MP為水解液中蛋白質(zhì)的總量，g。

1.3.5還原能力的測定

1.3.5.1FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[8]

FRAP（ferric reducing antioxidant power）工作液的配制：取25 mL 0.3 mol/L的醋酸鹽緩沖液（pH3.6），2.5mL10mmol/L的TPTZ溶液，2.5mL20mmol/L的FeCl3· 6H2O溶液，臨用前混合。

FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精密移取不同濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)液0.3 mL，準(zhǔn)確加入2.7 mL預(yù)熱至37℃的FRAP工作液，搖勻后放置10 min，于593 nm處測吸光值。以吸光度為縱坐標(biāo)，F(xiàn)eSO4濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5.2豬骨漿水解物亞鐵還原能力的測定[9]

準(zhǔn)確吸取豬骨漿水解物樣品溶液0.3 mL，加入2.7mL預(yù)熱至37℃的TPTZ工作液。搖勻后放置10min，于593 nm波長處測其吸光值（用雙蒸水作為參比）。以雙蒸水代替樣品加入FRAP工作液作為空白。由反應(yīng)后吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得的相應(yīng)的FeSO4濃度（μmol/L）定義為FRAP值。FRAP值越大，還原能力越強(qiáng)。

2　結(jié)果與分析

2.1豬骨漿的成分分析

豬骨漿的成分分析見表1。

表1　豬骨漿成分Table 1　Ingredient of swine bone seriflux

2.2FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

FeSO4溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1　FeSO4濃度與吸光值的關(guān)系曲線Fig.1　Relation curve of FeSO4concentrations and absorbance

由圖1可知，F(xiàn)eSO4濃度在100μmol/L～1000μmol/L之間時，吸光值與FeSO4溶液濃度呈線性關(guān)系，回歸方程為y=0.000 5x-0.016 8，R2=0.999 4。

2.3底物濃度對豬骨漿水解物亞鐵還原能力和水解度的影響

在加酶量1.5%，pH9.0，溫度55℃的條件下，酶解豬骨漿3 h?？疾斓孜餄舛龋?0%、25%、30%、35%）對亞鐵還原能力和水解度的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，F(xiàn)RAP值隨著底物濃度的增加呈先增加后減小的趨勢，底物濃度達(dá)30%時最大；水解度隨底物濃度的增加而增大，在底物濃度為30%～35%時較大，但由于底物濃度升高，加熱使其黏度上升，攪拌困難，且本試驗(yàn)主要考察水解物的抗氧化能力，因此確定底物濃度為30%。

圖2　底物濃度對FRAP值和水解度的影響Fig.2　The effect of substrate concentration on FRAP and degree of hydrolysis

2.4加酶量對豬骨漿水解物亞鐵還原能力和水解度的影響

在底物濃度30%，pH9.0，溫度55℃的條件下，酶解豬骨漿3 h?？疾旒用噶浚?.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）對亞鐵還原能力和水解度的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3　不同加酶量對FRAP值和水解度的影響Fig.3　The effect of enzyme dosage on FRAP and degree of hydrolysis

由圖3可知，1.5%的加酶量可以得到較好的FRAP值及水解度。加酶量在0.5%～1.5%時，F(xiàn)RAP值及水解度隨著加酶量的增加而增大。加酶量超過1.5%時水解度上升緩慢，且FRAP值有所下降。酶用量過多會增加成本，且過多的用酶量會使水解物的抗氧化能力下降，因此本試驗(yàn)確定加酶量為1.5%。

2.5pH對豬骨漿水解物亞鐵還原能力和水解度的影響

在底物濃度30%，加酶量1.5%，溫度55℃的條件下，酶解豬骨漿3 h?？疾靝H（8.0、8.5、9.0、9.5、10）對亞鐵還原能力和水解度的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，pH在8.0到9.0時，F(xiàn)RAP值及水解度隨著pH的增加而增大，pH在9.0到9.5時可以得到較好的FRAP值和水解度，低于9.0高于9.5的pH都不利于酶解進(jìn)行，這可能與pH對蛋白結(jié)構(gòu)及帶電荷情況的影響有關(guān)[7]。當(dāng)pH增至10時FRAP值和水解度明顯降低。從圖4中可以看出，pH9.0時水解度最大，此時FRAP值也最高，因此，選擇pH9.0。

圖4　pH對FRAP值和水解度的影響Fig.4　The effect of pH on FRAP and degree of hydrolysis

2.6溫度對豬骨漿水解物亞鐵還原能力和水解度的影響

在底物濃度30%，加酶量1.5%，pH 9.0的條件下，酶解豬骨漿3 h?？疾鞙囟龋?5、50、55、60、65℃）對亞鐵還原能力和水解度的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5　溫度對FRAP值和水解度的影響Fig.5　The effect of temperature on FRAP and degree of hydrolysis

由圖5可知，溫度為55℃時，F(xiàn)RAP值與水解度均達(dá)到最大。故選用55℃為酶解溫度。酶大多數(shù)由蛋白質(zhì)組成，只有在合適的溫度下才能保持其最佳的活性構(gòu)象，溫度過高時，因酶分子吸收過多能量，使其空間結(jié)構(gòu)被改變，導(dǎo)致變性，進(jìn)而活性降低甚至喪失催化功能[6]。

2.7時間對豬骨漿水解物亞鐵還原能力和水解度的影響

在底物濃度30%，加酶量1.5%，pH9.0，溫度55℃的條件下，酶解豬骨漿。考察反應(yīng)時間（1、2、3、4、5 h）對亞鐵還原能力和水解度的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6　時間對FRAP值和水解度的影響Fig.6　The effect of time on FRAP and degree of hydrolysis

由圖6可知，水解度隨著反應(yīng)時間的延長而增大，F(xiàn)RAP值在3h處達(dá)到最大。水解過程中蛋白質(zhì)隨著反應(yīng)時間的延長被逐步水解為小肽及氨基酸，而具有強(qiáng)抗氧化能力（由FRAP值體現(xiàn)）的肽段一般是由特定氨基酸殘基組成的，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，從豬骨漿蛋白上水解下來的具有強(qiáng)抗氧化能力的肽段將被進(jìn)一步水解，進(jìn)而喪失抗氧化活性[6]，導(dǎo)致整體的FRAP值降低。由于本試驗(yàn)的目的是得到具有較強(qiáng)抗氧化能力的肽段，因此，確定酶解時間為3 h。

3　結(jié)論

經(jīng)試驗(yàn)最終確定堿性蛋白酶（酶活力為8 000 U/g）酶解豬骨漿的最佳酶解條件為：底物濃度30%、加酶量1.5%、溫度55℃、pH 9.0、水解時間3 h。在此條件下得到的豬骨漿水解物的FRAP值為625 μmol/L，水解度為8.6%。

參考文獻(xiàn)：

[1]刁靜靜,孔保華,刁新平,等.骨蛋白水解物抗氧化活性及其作用模式[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,42(1):238-244

[2] 羅通彪.畜禽鮮骨的開發(fā)利用[J].食品研究與開發(fā),2003,24(5):70-73

[3]楊銘鐸,沈春燕,張根生.豬骨水解液營養(yǎng)成分分析研究[J].食品科學(xué),2009,30(14):272-275

[4]趙靜,丁奇,孫穎,等.豬骨湯中的游離氨基酸及其呈味特征分析[J].食品研究與開發(fā),2015,36(18):1-6

[5]刁靜靜.豬骨蛋白水解物的抗氧化機(jī)理以及在肉制品中應(yīng)用的研究[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2008

[6]付剛,李誠,馬長中.豬骨抗氧化肽的酶解制備研究[J].現(xiàn)代食品科技,2006,22(3):136-138

[7] 安廣杰,王璋,許時嬰.利用Alcalase蛋白酶生產(chǎn)牛骨水解明膠[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2004,30(3):52-55

[8]劉蕓,仇農(nóng)學(xué),楊璽玉.葡萄皮渣提取物總酚含量及體外抗氧化活性、抑菌活性[J].食品科學(xué),2011,32(1):5-9

[9]郭嬌嬌,方敏,林利美,等.蘋果多酚的提取及抗氧化活性研究[J].食品科學(xué),2011,32(20):95-98

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.007

收稿日期：2015-01-07

基金項(xiàng)目：天津市科研院所技術(shù)開發(fā)工作扶持經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（YSK2012-23）

作者簡介：張立娟（1983—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：肉制品加工。

The Effect of Enzymolysis Condition on Reducing Power and Hydrolyzed Degree of Swine Bone Seriflux

ZHANG Li-juan，WANG Qi-lin，WEN Lu-yun，WANG Yue-wei，ZHANG Bin，REN Ya-ni
（Food Research Institute Co.，Ltd.，Tianjin 301609，China）

Abstract：Antioxidant activity and degree of hydrolysis of swine bone seriflux hydrolysate at different enzymolysis condition were studied.Swine bone seriflux hydrolysate which was processed by bone cutter and bone paste machine was hydrolyzed by alcalase.The FRAP and degree of hydrolysis（DH）were determined at different substrate concentration，enzyme dosage，pH，temperature and hydrolysis time.By using single factordesign，the optimal enzymatic hydrolysis conditions by alcalase were as follows：substrate concentration 30%，enzyme dosage 1.5%，pH 9.0，temperature 55℃，hydrolysis time 3 h.The FRAP and DH of swine bone seriflux on this condition were 625 μmol/L and 8.6%respectively.

Key words：enzymolysis condition；swine bone seriflux hydrolysate；FRAP；degree of hydrolysis