華州山藥提取物對兩種自由基清除試驗(yàn)研究

王征帆，楊艷麗，孫曉霞，劉霞，齊春梅，李莎（.渭南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，陜西渭南74000；.陜西國防工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院熱能化工系，陜西西安7030）

華州山藥提取物對兩種自由基清除試驗(yàn)研究

王征帆1，楊艷麗2，孫曉霞1，劉霞1，齊春梅1，李莎1
（1.渭南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，陜西渭南714000；2.陜西國防工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院熱能化工系，陜西西安710302）

摘要：為了進(jìn)一步開發(fā)利用山藥資源，以無水乙醇和水分別為溶劑提取了陜西華縣產(chǎn)華州山藥的活性成分，對其乙醇提取物和水提取物清除羥基自由基、DPPH自由基的能力進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，山藥樣品提取物對這兩種自由基均具有較強(qiáng)的清除作用，但清除效果各不相同，其中水提取物對DPPH自由基的清除率最大達(dá)到74.5%，無水乙醇提取物對羥基自由基清除率最大達(dá)到58.6%。

關(guān)鍵詞：山藥；羥基自由基；DPPH自由基；清除率

山藥，屬于多年生草本薯蕷科植物，其成熟的根莖可作為藥食兩用類植物食用。因其營養(yǎng)豐富，自古以來就被視為物美價(jià)廉的補(bǔ)虛佳品，既可作中藥治病，又可作蔬菜食用。作為中藥它具有補(bǔ)虛抗衰、補(bǔ)氣養(yǎng)血、滋陰補(bǔ)陽等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，山藥中含有的糖蛋白、鞣質(zhì)、山藥堿以及微量元素鈣、磷、鐵等，具有誘生干擾素的作用，可以防止衰老[1]。陜西華縣產(chǎn)的華州山藥是陜西渭南的特色農(nóng)產(chǎn)品，華縣位于渭河的下游，其河灘沙土細(xì)疏，為山藥生長提供了很好的環(huán)境，產(chǎn)出的根莖具有條長、皮薄、味道濃郁等特點(diǎn)，具有很高的藥用價(jià)值。在《本草綱目》上有華州山藥同懷山藥同入中藥，可“健脾胃，止腰痛，益腎氣，治虛勞，止泄痢，化痰涎，潤皮毛”[2]。目前對于華州山藥提取物對自由基的清除研究鮮見報(bào)道，為此我們采用分光光度法對華州山藥乙醇提取物和水提取物，以分光光度法對提取物對羥基自由基和DPPH自由基的清除效果進(jìn)行了測定，其結(jié)果對華州山藥資源在飲食，醫(yī)療保健等領(lǐng)域的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

華州山藥：采于陜西華縣，經(jīng)過60℃烘干后保存。

乙醇（分析純）；FeSO4（分析純）；羅丹明B（分析純）；鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）；DPPH自由基（分析純）；鹽酸（分析純）；去離子水。

TU-1800PC型紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DGB/20-002型干燥箱：重慶試驗(yàn)設(shè)備廠制造；BS2245型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；680型電熱恒溫水浴鍋：北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠；PXS-270型精密離子計(jì)：上海精密儀器公司。

1.2樣品活性成分提取

將新鮮的華州山藥用流動(dòng)水沖洗干凈，切成小片放置入干燥的燒杯中，在60℃恒溫烘箱內(nèi)至完全烘干。取出烘干后的樣品用研砵研成粉末狀干燥保存，備用。利用電子天平準(zhǔn)確稱取烘干干燥后的樣品粉末2.000 0 g兩份分別放入到兩個(gè)干燥的圓底燒瓶內(nèi)，各加入100 mL的無水乙醇和100 mL的去離子水在45℃的恒溫水浴鍋中分別浸泡8 h提取活性成分，用濾紙和干凈的漏斗將兩個(gè)提取液分別均過濾至兩個(gè)250 mL的容量瓶中，在過濾后的濾渣中再加各自的提取劑，以同樣方法提取，再講二次濾液過濾至對應(yīng)容量瓶內(nèi)，定容至刻度待測[3]。

1.3提取物對·OH清除試驗(yàn)

·OH是所有活性氧自由基里毒性最大的一種自由基，它可以發(fā)生羥基化等反應(yīng)，使氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)氧化，是損害生物體組織細(xì)胞最大的一種活性自由基。生物體在新陳代謝過程中即可產(chǎn)生這種自由基，從而造成對生物體內(nèi)細(xì)胞膜的過氧化，蛋白質(zhì)的交聯(lián)變性，核酸損傷等，給生物體帶來很大的危害[4]。目前研究已經(jīng)證明·OH與人體的衰老、腫瘤、輻射損傷等密切相關(guān)，因此對·OH清除的研究尤為重要。適當(dāng)給生物體補(bǔ)充外源性的抗氧化劑，即可清除體內(nèi)產(chǎn)生的·OH，從而改善這些狀況。我們以分光光度法測定了華州山藥樣品乙醇提取物和水提取物對·OH的清除作用，清除效果以清除率表示。

1.3.1測定方法

以Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH，并立即與羅丹明B發(fā)生氧化發(fā)應(yīng)，使其退色，吸光度降低為A0，當(dāng)加入樣品提取物后，提取物中的活性成分可以清除反應(yīng)產(chǎn)生的·OH，從而使體系吸光度下降的程度降低為可以使體系吸光度下降的程度降低為AS，若羅丹明B的吸光度為A，則清除率D按下面公式計(jì)算。

條件的控制會(huì)對對·OH的生成以及樣品提取物對其清除作用有較大影響，為此我們通過單因素試驗(yàn)確定最佳試驗(yàn)條件。具體如下：

1.3.1.1pH的控制

分別配置pH 2.0～6.0的鄰苯二甲酸氫鉀-HCl緩沖溶液，加入到羅丹明B-FeSO4-H2O2體系中測定體系ΔA的變化，結(jié)果表明，采用pH 2.5的緩沖溶液，體系的ΔA值最大，因此選擇最佳pH條件為pH=2.5。

1.3.1.2Fe2+加入量的控制

當(dāng)其它條件不變時(shí)，分別加入0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 mL的Fe2+標(biāo)準(zhǔn)溶液（5×10-3mol/L）對體系ΔA值測定，結(jié)果表明，開始Fe2+標(biāo)液體積越大ΔA值也逐漸增大，但達(dá)到2.50 mL后時(shí)，ΔA值不在變化，因此最佳的Fe2+用量控制在2.50 mL最好。

1.3.1.3H2O2加入量的控制

分別加入0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL H2O2（2×10-4mol/L）測定ΔA值，試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著H2O2用量的增加ΔA值增大，當(dāng)加入體積達(dá)到2.00 mL時(shí)，ΔA值穩(wěn)定，所以本試驗(yàn)采用2×10-4mol/L H2O2溶液用量為2.00 mL。

1.3.1.4顯色劑加入量的控制

分別加入0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液（2×10-4mol/L），測定空白參比體系和羥基自由基生成體系吸光度，結(jié)果表明，羅丹明B體積越大，體系ΔA越大，但體積超過2.00 mL時(shí)，由于空白參比液的吸光度太大，大大超出測定儀器讀數(shù)范圍，因此體積用量不宜超過2.00 mL。

1.3.1.5試劑加入順序

試驗(yàn)以羅丹明B的顯色作用來測定·OH，因此必須保證體系所產(chǎn)生的羥自由基能與羅丹明B充分反應(yīng)，再加入試劑時(shí)應(yīng)該先加入羅丹明B和緩沖溶液，再加入Fe2+和樣品提取物，最后再加入H2O2。

1.3.1.6反應(yīng)時(shí)間控制

在上面的條件下對體系測定吸光度，每隔1 min讀數(shù)，結(jié)果表明，在1 min～5 min內(nèi)，吸光度數(shù)值迅速下降，在5 min～10 min內(nèi)，數(shù)值無變化，說明反應(yīng)完全，因此最佳的反應(yīng)時(shí)間控制在7 min后讀數(shù)。

1.3.2·OH清除率測定

在以上最佳條件下我們測定了樣品提取物對·OH的清除率，具體做法是：給3支50 mL容量瓶中都先加入羅丹明B標(biāo)液各2.00 mL和緩沖溶液（pH 2.5）5.00 mL，然后向其中兩支容量瓶中加入Fe2+標(biāo)液2.50 mL和H2O2標(biāo)液2.00 mL，另一支不加，定容搖勻，放置7 min后在554 nm下測定其吸光度，分別記錄讀數(shù)A和A0。把樣品提取物加入到·OH生成體系中，在相同條件檢測，記錄吸光度為AS，按1.3.1計(jì)算清除率。

1.4提取物對DPPH自由基清除試驗(yàn)

DPPH自由基是一種氮中心自由基，由于自身結(jié)構(gòu)中有3個(gè)苯環(huán)，空間位阻作用使其表現(xiàn)的非常穩(wěn)定。由于該自由基存在單電子，在515 nm處有較強(qiáng)吸收，當(dāng)樣品提取物中含有自由基清除劑存在時(shí)，該自由基的單電子被配對，顏色就變淺，吸光度變小。研究發(fā)現(xiàn)這種退色程度與其接受電子之間存在明顯的量效關(guān)系[4]。因此，可直接在517 nm波長處測定吸光度的變化來評價(jià)所加入提取物對該自由基的清除情況。具體做法是：

準(zhǔn)確稱取0.008 0 g的DPPH自由基于50 mL容量瓶中，以95%乙醇溶解得到DPPH自由基標(biāo)準(zhǔn)溶液（4×10-4mol/L）備用。分別移取樣品提取物溶液1.00 mL 于50 mL容量瓶，以95%乙醇定容至刻度，作為測定參比溶液使用。移取配置好的DPPH自由基標(biāo)液3.00 mL，于50mL容量瓶中以95%乙醇定容，在517nm下測定，記錄吸光度為Ac；另取樣品提取物1.00 mL于50 mL容量瓶，加入DPPH自由基標(biāo)液3.00 mL，測定吸光度并記錄為Ai，則清除率D按下式計(jì)算：

2　測定結(jié)果

按照上述1.3和1.4中的方法，測定了兩種樣品提取物對羥基自由基和DPPH自由基自由基的清除率，結(jié)果如表1所示。

表1　樣品提取物對自由基清除率測定Table 1　Determination of free radical scavenging rate of sample extracts

由表1中的數(shù)據(jù)可以看出，樣品的提取物對羥基自由基和DPPH自由基都有一定的清除能力，但清除率不盡相同。其中樣品無水乙醇提取物對羥基自由基有較強(qiáng)清除作用，清除率達(dá)到58.6%，水提取物對DPPH自由基有很強(qiáng)清除作用，清除率為74.5%。

3　結(jié)論

以無水乙醇和水為提取試劑，提取了陜西華州山藥的活性成分，并測定了提取物對羥基自由基和DPPH自由基的清除率。結(jié)果表明，樣品提取物對兩個(gè)自由基均具一定的清除作用，但不同提取劑提取物對兩個(gè)自由基的清除效果不同。DPPH自由基的清除試驗(yàn)說明，水提取物清除效果好，應(yīng)當(dāng)為首選；羥基自由基的清除試驗(yàn)說明，無水乙醇提取物清除效果較好。本研究僅對兩種提取物在體外的抗自由基能力進(jìn)行了測定，其在體內(nèi)的自由基清除作用以及樣品提取物中各種活性成分對自由基清除率的貢獻(xiàn)值得進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]尚曉婭.山藥多糖的制備及其體外抗氧化活性[J].化學(xué)研究,2010, 21(2):72-75

[2]劉健.華州山藥無公害栽培技術(shù)[J].西北園藝,2013(5):15-16

[3]王征帆.四種護(hù)脾養(yǎng)胃類中藥水提物抗氧化能力測定[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013,25(9):1271-1273

[4]鄭榮梁,黃中洋.自由基生物學(xué)[M].北京:高等教育出版社,2007

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.002

收稿日期：2014-05-02

基金項(xiàng)目：陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2014JQ2074）；渭南師范學(xué)院科研項(xiàng)目（15YKP007）；渭南師范學(xué)院教改項(xiàng)目（JG201529）；渭南師范學(xué)院特色學(xué)科項(xiàng)目（14TSXK04）；渭南師范學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（15TXK032）

作者簡介：王征帆（1981—），男（漢），副教授，碩士，研究方向：食品及環(huán)境分析。

Research on Radical Scavenging in Huazhou Yam Extracts

WANG Zheng-fan1，YANG Yan-li2，SUN Xiao-xia1，LIU Xia1，QI Chun-mei1，LI Sha1
（1.School of Chemistry and Life Science，Weinan Normal University，Weinan 714000，Shaanxi，China；2.Department of Heat Energy and Chemical Engineering，Shaanxi Institute of Technology，Xi'an 710302，Shaanxi，China）

Abstract：The active ingredients of yam from Huazhou Shaanxi were extracted with hydroxyl radicals and water respectively for further development and utilization of it，after the comparison of their extract scavenging ability of hydroxyl radicals and DPPH free radicals.Results showed that yam samples have strong scavenging effect，but with different effect.Water extract on the DPPH free radicals clearance rate reached 74.5%，maximum alcohol extract on hydroxyl radicals clearance up to 58.6%.

Key words：Huazhou yam；hydroxyl radicals；DPPH free radicals；clearance rate