響應(yīng)面法優(yōu)化S2菌株的培養(yǎng)條件

劉江紅等

摘要：利用快速篩選方法從大慶采油三廠油田采出水中篩選出高產(chǎn)生物表面活性劑菌株S2，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬.對(duì)S2菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑進(jìn)行提取及純化后，通過(guò)離子鑒別實(shí)驗(yàn)及紅外光譜法對(duì)其進(jìn)行定性檢測(cè)，確定其種類為非離子型脂肽類.以菌種S2產(chǎn)生的發(fā)酵液的乳化指數(shù)（E24）為指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化方法對(duì)S2菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以接種量、pH值、溫度、搖床轉(zhuǎn)速為因素優(yōu)化對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn).在此模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)二次回歸方程得出最佳值是pH為7.2、溫度為43.5 ℃ 、接種量為5.2%（V/V）、搖床轉(zhuǎn)速為162 r/min.在優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)條件下，測(cè)得菌株S2所產(chǎn)生發(fā)酵液的最優(yōu)E24為81.20%.

關(guān)鍵詞：發(fā)酵液；紅外光譜法；響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)；乳化；菌株

中圖分類號(hào)：TE357 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract：S2 strain that highly produces biosurfactant was screened from the oilfield water of three plants in Daqing Oilfield in the rapid screening method， and the S2 strain was identified as Bacillus sp.. Through FTIR and ion identification test， S2 biosurfactant was identified as nonionic lipopeptide biosurfactant. This experiment treated emulsification index （E24） of S2 strain fermentation broth as the object. Through response surface optimization method， the culture conditions （inoculum， pH， temperature and rotation speed） of the S2 strain were optimized. On the basis of response surface model， the optimum pH value was 7.2 and the temperature was 43.5 ℃， inoculation of 5.2% （V/V）， rotation speed was 162 r/min through the quadratic regression equation. Under the optimal condition， the best E24 of S2 strain fermentation broth was 81.20%.

Key words： fermentation broth； infrared spectral measurements； response surface experiments； emulsification； strain

生物表面活性劑是微生物在一定條件下發(fā)酵產(chǎn)生且具有表面活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其性質(zhì)為同時(shí)具有親油性和親水性[1].生物表面活性劑對(duì)疏水性物質(zhì)具有有效的乳化、潤(rùn)濕、分散、溶解作用，同時(shí)使體系的表/界面張力有所下降[2-3].自然界中存在許多微生物（細(xì)菌、真菌等），這些微生物能夠在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中分泌產(chǎn)生不同種類的生物表面活性劑.現(xiàn)在化學(xué)合成的表面活性劑因其造成環(huán)境污染而使其使用面臨著巨大的環(huán)境壓力，生物表面活性劑具有功能的多樣性和對(duì)環(huán)境的友好性，且在食品工業(yè)、原油采出、污染環(huán)境的修復(fù)等領(lǐng)域中起著越來(lái)越重要的作用.

作為一種綜合性優(yōu)化方法，響應(yīng)面優(yōu)化法結(jié)合了數(shù)學(xué)方法和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，主要內(nèi)容包括優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)曲面分析和擬合優(yōu)化計(jì)算3部分，被廣泛地應(yīng)用在微生物培養(yǎng)條件優(yōu)化和生化反應(yīng)中[4].本實(shí)驗(yàn)通過(guò)BoxBehnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)的應(yīng)用對(duì)生物表面活性劑高產(chǎn)量菌株S2的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以乳化指數(shù)E24為響應(yīng)值，pH值、溫度、接種量及搖床轉(zhuǎn)速為其主要影響因素，通過(guò)實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)并分析各因素的最佳條件，從而提高乳化指數(shù).通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷?D響應(yīng)曲面圖和等高線圖的分析，可以直觀地得出各因素與乳化指數(shù)E24的響應(yīng)關(guān)系及各因素間交互作用的顯著程度[5-6].采用DesignExpert 8.0.5軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)處理及模型建立.

1 材料與方法

1.1材料與設(shè)備

1.1.1主要設(shè)備

XZD3型界面張力儀，上海平軒科學(xué)儀器有限公司；超聲細(xì)胞破碎儀，賽飛（中國(guó)）有限公司；薄層色譜層析缸（100×100），天津市思利達(dá)科技有限公司 ；紅外光譜儀，大塚電子（蘇州）有限公司.

1.1.2菌株來(lái)源

以快速法為篩選方法，從大慶采油三廠的油田采出水中篩選出高產(chǎn)生物表面活性劑純菌種S2，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室一系列生理、生化實(shí)驗(yàn)鑒定后，確定S2菌種為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）.

1.1.3培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20 g，mNaNO3=0.5 g，mKH2PO4=1 g，mNa2HPO4=2 g， mMgSO4=0.02 g，mFeSO4=0.01 g，mNaCl=5 g，mCaCl2=0.08 g，pH值為7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)酵液的乳化指數(shù)（E24）測(cè)定[7]

將經(jīng)過(guò)72 h震蕩培養(yǎng)后的發(fā)酵液用離心機(jī)去除菌體細(xì)胞，取其5 mL和5 mL液體石蠟混合于比色管中，在100 W的超聲波中進(jìn)行細(xì)胞粉碎處理，待形成白色乳化液后，靜置24 h，測(cè)量E24的公式如式（1）所示.