環(huán)境中抗藥菌株的分離、鑒定及其抑菌活性研究

閻春蘭 央青卓瑪 韋英美 王濤 雷世庭 王磊

摘要：采用革蘭氏染色技術、生理生化試驗和16S rDNA序列分析，對分離篩選自土壤中的抗藥菌株進行鑒定；測定菌株的生長曲線了解菌株的生長情況；耐藥性和抑菌性試驗檢測菌株的特性。結(jié)果表明，從土壤中分離得到11種抗藥菌株，經(jīng)鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas）、貪噬菌屬（Variovorax）、溶桿菌屬（Lysobacte）和短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）等。其中，菌株XC-10、XN-4、XN-5和XN-6等分別對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和藤黃微球菌（Micrococcus luteus）等細菌的生長有不同程度的抑制作用；11種菌株分別對終濃度為10 μg/mL壯觀霉素和20 μg/mL氨芐青霉素等具有顯著的耐藥性。

關鍵詞：抗藥菌株；分離鑒定；16S rDNA；抑菌特性

中圖分類號：Q93-331 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）10-0060-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.10.014

Isolation，Identification and Antimicrobial Traits of Antibiotic

Resistant Strains in Environment

YAN Chun-lan，YANG-QING Zhuo-ma，WEI Ying-mei，WANG Tao，LEI Shi-ting，WANG Lei

（College of Life Sciences，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China）

Abstract： By using Gram stain， physiological property and phylogenetic trees based on 16S rDNA，the different antibiotic resistant strains which were screened and isolated from soil were identified. Then the growth chart of strains were measured，and the drug resistance and the antimicrobial characteriatics were detected. The results showed that 11 antibiotic resistant strains were isolated and identified from soil. According to morphological characteristics and the phylogenetical analysis of 16S rDNA，these strains were determined to belong to Pseudomonas， Variovorax， Lysobacte and Brevibacillus. And the strains of XC-10，XN-4，XN-5 and XN-6 had different inhibitory effects on the growth of bacteria such as Staphylococcus aureus，Bacillus subtilis，and Micrococcus luteus. Screened had obvious inhibiting effect on six common indicator strains. The 11 strains all showed significant drug-resistance to the final concentration of 10 μg/mL spectinomycin and 20 μg/mL ampicillin.

Key words： antibiotic resistant strains； isolation and identification； 16S rDNA； antimicrobial characteriatics

抗生素是在動植物或者微生物上提取的能夠殺滅病菌的代謝產(chǎn)物[1]，是人類對抗細菌感染的有效手段。近些年來，傳統(tǒng)的放線菌、鏈霉菌和少數(shù)細菌產(chǎn)生的抗生素已不能對抗大部分病原菌[2]，細菌耐藥性問題越來越受到人們關注[3，4]，而有些細菌天然的對一種以上的藥物具有耐受性[5]，出現(xiàn)了大量的超級細菌如耐青霉素肺炎菌（Penicillin-resistant Streptococcus pneumonia，PRSP）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）和耐萬古霉素腸球菌（Vancomycin-resistant Enterococcus，VRE）等[6，7]。針對目前耐藥性日益嚴重的問題，除繼續(xù)開發(fā)傳統(tǒng)的抗生素外，也進行了新型的抗耐藥菌抗生素的研發(fā)，尤其是一些新結(jié)構(gòu)類別抗生素和（半）合成抗生素的研究開發(fā)[8]，以及非抗生素療法，如噬菌體及噬菌體裂解酶療法[9]、CRISPR-Cas9等的應用[10]。也有研究表明，細菌產(chǎn)生的細菌素，與其他的細菌素、抗生素、噬菌體裂解酶或者其他的抗微生物藥物結(jié)合，可以用于防治病原菌[11]。本研究自青海西寧污水區(qū)和四川西昌醫(yī)院附近的土壤中分離篩選抗藥性菌株，初步了解其培養(yǎng)特征、形態(tài)特征，通過16S rDNA序列分析及生理生化試驗鑒定菌株。檢測菌株的耐藥性和抑菌性，為尋找高效新型抗菌藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗篩菌土樣采集于青海西寧污水區(qū)的土壤，以及四川西昌醫(yī)院附近的土壤。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH 7.0～7.2，瓊脂粉15～20 g，去離子水補充至1 000 mL。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸出物5 g，NaCl 10 g，pH 7.0～7.2，瓊脂粉15～20 g，去離子水補充至1 000 mL。

1.2 抗藥性菌株的篩選、純化與鑒定

稱取10 g采集到的土樣，加入至90 mL含有玻璃珠的無菌水中，200 r/min振蕩15～20 min。吸取1 mL振搖后的液體，加入至含有9 mL無菌水的試管中，混勻，進行梯度稀釋。分別吸取0.1 mL 10-3、10-4、10-5、10-6稀釋度的液體，均勻涂布到含終濃度為50 μg/mL氨芐青霉素（記為Ap50）和終濃度為10 μg/mL卡那霉素（記為Km10）的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。挑取形態(tài)特別、生長良好的單菌落，劃線于Ap50或Km10牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，依此挑取單菌落劃線純化5～6次，以獲得純化的抗藥性菌株。

將上述純化得到的單菌落，接種于Ap50或Km10牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48～64 h。進行革蘭氏染色，以確定菌株類別。在光學顯微鏡下觀察菌株大小、顏色和形態(tài)等特征。

挑取上述純化后的單菌落，進行生理生化試驗。生理生化指標[12]包括吲哚試驗、甲基紅試驗、伏普試驗和檸檬酸鹽試驗。

提取菌株總DNA[13，14]。參照文獻[13]的方法擴增菌株16S rDNA。用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AxyPrep，杭州，中國）純化回收16S rDNA產(chǎn)物。將純化后的16S rDNA與克隆載體pMD18-T于16 ℃條件下連接12 h，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細胞中，均勻涂布至含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃條件下培養(yǎng)16 h。挑取陽性克隆，送至天一輝遠生物技術有限公司進行測序。將測序得到的16S rDNA序列與NCBI中已知菌株的16S rDNA序列進行比對，使用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.3 菌株生長曲線的測定

將上述純化得到的菌株接種至5 mL Ap50或Km10牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。按照5%接種量接種上述細菌母液至5 mL Ap50或Km10牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，依次培養(yǎng)0、2、4、8、12、16、20、24或36 h。待培養(yǎng)結(jié)束后，于600 nm波長下測定菌液吸光度。

1.4 細菌耐藥性試驗

將上述純化得到的菌株分別接種至含有終濃度分別為2 μg/mL的四環(huán)素（記為Tc2）、20 μg/mL的氨芐青霉素（記為Ap20）、20 μg/mL的卡那霉素（記為Km20）、5 μg/mL的慶大霉素（記為Gm5）、50 μg/mL的鏈霉素（記為St50）、10 μg/mL壯觀霉素（記為Sp10）、2 μg/mL的氯霉素（記為Cm2）的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h或48 h，觀察菌落生長情況。

1.5 細菌抑菌性試驗

細菌的抑菌性試驗參照文獻[15]進行，挑取上述純化的單菌落分別接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，吸取上述各菌液100 μL，加入至涂布有大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、嗜線蟲沙雷氏菌（Serratia nematodiphila）和產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）（作為指示菌）的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上的牛津杯中，于37 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離及鑒定

分離篩選得到11株抗藥性菌株，依次命名為XC-1、XC-2、XC-4、XC-7、XC-10、XC-11、XN-1、XN-4、XN-5、XN-6和XN-9。11株菌株具體形態(tài)特征如表1所示，菌落顏色為黃色或乳白色；除菌株XC-4、XC-11和XN-6菌落表面凹陷或皺縮外，其余菌株的菌落表面光滑。除菌株XC-7和XN-9為球狀外，其他菌株形態(tài)為短桿狀或長桿狀；此外，菌株XC-11、XN-1和XN-4具有芽孢結(jié)構(gòu)，其他8種菌株均無芽孢。革蘭氏染色結(jié)果表明，菌株XC-1、XC-4、XC-7、XN-1、XN-6和XN-9為革蘭氏陽性菌，其他菌株均為革蘭氏陰性菌。生理生化試驗表明，這11種菌株的吲哚試驗和伏普試驗均呈陰性，除菌株XC-7和XN-1外，其他菌株的甲基紅試驗均為陰性。此外，除菌株XC-11外，其他菌株的檸檬酸鹽試驗均為陰性。

將11種菌株的16S rDNA序列上傳至NCBI中，與已知菌株的16S rDNA序列進行比對，構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹如圖1所示。由圖1、表2可知，菌株XC-1的16S rDNA序列與纖維單胞菌屬的16S rDNA序列（登錄號：NR_119095.1）相似性達98%，且兩者處于系統(tǒng)進化樹的同一分支上?；谛螒B(tài)學觀測、生理生化試驗及16S rDNA序列分析可知，菌株XC-1屬于纖維單胞菌屬，其他10種菌株被鑒定為假單胞菌屬和短芽孢桿菌屬等。

2.2 菌株生長情況的測定

如圖2所示，11株菌株在0～4 h，生長緩慢，處于延滯期；在4～16 h，菌株均快速繁殖，處于對數(shù)期；到16 h后，11種菌株的生物量基本達到最大值，到24 h后，OD600 nm減小，菌株進入衰亡期。根據(jù)11種菌株的生長曲線，可選取16 h后的菌株作為起始菌株進行擴大培養(yǎng)。

2.3 菌株的耐藥性檢測

使用四環(huán)素和氨芐青霉素等7種抗生素對11種菌株進行耐藥性檢測，由表3可知，耐藥性處理24和48 h后，各菌株的生長情況基本不變；20 μg/mL卡那霉素（Km20）對菌株XN-1的生長具有抑制作用，對菌株XC-2、XC-7、XC-11的生長具有較弱的影響，而菌株XC-4、XC-1、XC-10、XN-4、XN-5、XN-6對Km20有較強的耐藥性；5 μg/mL慶大霉素（Gm5）對菌株XN-1的生長具有抑制作用，對XC-4、XN-4、XN-5、XN-6、XN-9菌株的生長具有較弱的影響，而菌株XC-1、XC-7、XC-11對Gm5有較強的耐藥性；50 μg/mL鏈霉素（St50）對菌株XC-1、XC-2、XN-1和XN-5的生長均具有抑制作用；此外，11種菌株分別對10 μg/mL壯觀霉素（Spe10）和20 μg/mL氨芐青霉素（Amp20）呈現(xiàn)不同程度的耐藥性。菌株XN-1除對Spe10和Amp20具有耐藥性外，對其余檢測的抗生素均不具有耐藥性。

2.4 菌株的抑菌性檢測

篩選純化得到的11種菌株對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌、嗜線蟲沙雷氏菌和產(chǎn)氣腸桿菌（作為指示菌）生長的抑制作用如表4所示。XC-1、XC-2、XC-4、XC-7、XC-11、XN-1和XN-9的代謝產(chǎn)物對6種指示菌的生長均沒有抑制作用。此外，菌株XC-10、XN-4、XN-5和XN-6的代謝產(chǎn)物能不同程度地抑制部分指示菌的生長。其中，菌株XN-5的代謝產(chǎn)物對所有指示菌的生長均具有抑制作用。

3 小結(jié)與討論

從土壤中分離得到11種抗藥菌株，經(jīng)鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas）、貪噬菌屬（Variovorax）、溶桿菌屬（Lysobacte）和短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）等。鏈霉菌屬、枯草芽孢桿菌屬和假單胞菌屬等是常見的能夠產(chǎn)生抗生素的微生物[16-18]，同屬的菌株在形態(tài)特征和生理生化特性等方面往往會有相似之處。已有的研究結(jié)果可以為進一步研究已鑒定種類的微生物的抗菌特性等提供線索[19]。

在檢測中，11種菌株中有10株，即分離到的菌株中有90.91%的菌株，對6種以上的抗生素具有不同程度的耐藥性，占到檢測抗生素的85.71%，表明自然環(huán)境中菌株的多種耐藥性已非常嚴重，與前人的研究結(jié)果一致[20]。細菌耐藥性，尤其多重耐藥性的產(chǎn)生是一個世界性的公共衛(wèi)生難題[21，22]，加大了抗感染治療的難度，如大腸埃希氏菌和肺炎克雷伯菌等對碳青霉烯類等抗生素的耐藥率較高[23]。本研究中的多個菌株對各種不同抗生素均呈現(xiàn)不同的耐藥性，為后期探索菌株中抑菌性物質(zhì)與抗生素的結(jié)合用于防治病原菌奠定了基礎。

XC-10、XN-4、XN-5和XN-6為分別來源于不同菌屬的細菌，包括貪噬菌屬（Variovorax）、劍菌屬（Ensifer）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）和短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）。這些細菌能夠明顯抑制常見微生物的生長，但其機制不明，因此分離純化這些抗藥菌株代謝產(chǎn)物中的有效成分，并將其與抗生素相結(jié)合，應用于病原菌的防治等，均有待進一步的研究。

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