超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定葡萄中8種植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留量

王遠(yuǎn)　邢麗杰　向曉黎等

摘要

[目的]建立超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS/MS）同時(shí)測定葡萄中8種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量的方法。[方法]將供試葡萄樣品經(jīng)乙腈提取，分散固相萃取，采用BEH C18色譜柱分離，以乙腈和水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。采用電噴霧離子化，正負(fù)離子分段掃描和多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）檢測，外標(biāo)法定量。[結(jié)果]試驗(yàn)得出，縮節(jié)胺、矮壯素、赤霉素在2.5 ～500 ng/ml，6芐氨基嘌呤、對(duì)氯苯氧乙酸、氯吡脲、多效唑、2，4二氯苯氧乙酸在1～200 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.990。8種植物生長調(diào)節(jié)劑的方法檢出限為0.2～0.5 μg/kg，方法定量限為0.5～1.5 μg/kg，樣品添加回收試驗(yàn)的平均回收率為73.5%～102.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%～9.7%（n=7）。[結(jié)論]該方法簡單、靈敏度高、分析時(shí)間短，適用于葡萄中8植物生長調(diào)節(jié)劑的測定。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；植物生長調(diào)節(jié)劑；殘留；葡萄

中圖分類號(hào) S481+.8；O657.63 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）15-247-05

Determination of 8 Plant Growth Regulator Residues in Grape by UPLCMS/MS

WANG Yuan，XING Lijie，XIANG Xiaoli et al

（Food Quality Supervision and Testing Center of Ministry of Agriculture，Xinjiang Academy of Agricultural Reclamation Science，Shihezi，Xinjiang 832000）

Abstract [Objective] A method was established for determining 8 plant growth regulator residues in grapes by ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry（UPLCMS/MS）.[Method] Samples were extracted with acetonitrile，and cleaned up dispersivesolid phase extraction.The target analytes were separated on a BEH C18 column with gradient elution using a mobile phase made up of acetonitrile and water.The samples were detected under positive and negative multiple reactions monitoring（MRM） mode through polarity switching between time segments.[Result] The linearities of mepiquat chloride，chlormequat chloride and gibberellic acid were in the concentration range of 2.5-500 ng/ml， 6benzylaminopurine，4chlorophenoxyaceticacid，forchlorfenuron，paclobutrazol and 2，4dichlorophenoxyacetic were in the concentration range of 1-200 ng/ml，with the correlation coefficients higher than 0.990.The limits of detection（LOD） and the limits of quantitation（LOQ） of the method were 0.2-0.5 μg/kg and 0.5-1.5 μg/kg.The average spiked recovery rates were in the range of 73.5%-102.2%.The relative standard deviation（RSD，n=7） was 2.9%-9.7%.[Conclusion] The method proved to be simple，sensitive，rapid and suitable for the determination of 8 plant growth regulator residues in grapes.

Key words Ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry（UPLCMS/MS）； Plant growth regulator； Residue； Grape

植物生長調(diào)節(jié)劑（Plant growth regulator，PGRs）是一種能促進(jìn)植物生長、提高作物產(chǎn)品質(zhì)量和品質(zhì)的一類植物激素[1]。植物生長調(diào)節(jié)劑可分為植物生長促進(jìn)劑、延緩劑和抑制劑3大類。目前，生產(chǎn)上廣泛使用的類別有生長素類（吲哚3乙酸、吲哚3丁酸、α萘乙酸、2，4二氯苯氧乙酸、對(duì)氯苯氧乙酸和對(duì)氟苯氧乙酸）、細(xì)胞分裂素類（異戊烯腺嘌呤、氯吡脲和6芐氨基嘌呤）和赤霉素類等[2]。近年來，由于植物生長調(diào)節(jié)劑使用不當(dāng)引起的食品安全問題逐漸增多，植物生長調(diào)節(jié)劑在農(nóng)作物中的殘留可通過食物鏈進(jìn)入人體，輕者造成腹瀉等疾病，重者使人體免疫力下降，骨骼疏松，甚至有致畸、致癌、致突變等嚴(yán)重后果[3]。

美國、歐盟、澳大利亞、加拿大和日本相繼對(duì)常用植物生長調(diào)節(jié)劑的一種或幾種制定了最高殘留限量（MRLs）。我國對(duì)于植物生長調(diào)節(jié)劑的規(guī)定相對(duì)較少，國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763中涉及到常用植物生長調(diào)節(jié)劑有2，4二氯苯氧乙酸、矮壯素、多效唑和氯吡脲，但是對(duì)葡萄中殘留限量作規(guī)定只有2，4二氯苯氧乙酸和氯吡脲，最高殘留限量均為005 mg/kg[4]。

目前對(duì)于常用植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的研究主要包括：高效液相色譜法[5-6]、氣質(zhì)聯(lián)用法[7-8]和液質(zhì)聯(lián)用法[9-14]。液相色譜法由于抗干擾能力差，存在一定的假陽性；氣質(zhì)聯(lián)用前處理較為復(fù)雜，檢測時(shí)間較長；液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)于物質(zhì)的分析從結(jié)構(gòu)上進(jìn)行確認(rèn)，大大降低了假陽性，同時(shí)前處理方法簡單、時(shí)間短，適用于多組分快速檢測。新疆是我國主要的葡萄產(chǎn)區(qū)，但是在葡萄中植物生長調(diào)節(jié)劑限量制定方面還不完善，因此，建立葡萄中常用植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量的檢測方法尤為重要。該研究主要集中在葡萄中常使用的8種植物生長調(diào)節(jié)劑，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，正負(fù)離子同時(shí)切換測定葡萄中8種植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留量，該方法操作簡便、靈敏度高，可滿足同時(shí)對(duì)葡萄中多種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留進(jìn)行定性及定量分析的要求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑。

乙腈 （HPLC級(jí)），德國MERCK公司；甲醇（HPLC級(jí)），德國CNW公司；N丙基乙二胺吸附劑（PSA），上海安譜科學(xué)儀器有限公司；無水硫酸鎂、氯化鈉、乙酸乙酯，均為分析純。所用水為超純水。8種植物生長調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)品：赤霉素（gibberellic acid，GA3）、6芐氨基嘌呤（6benzylaminopurine，6BA）、對(duì)氯苯氧乙酸（4chlorophenoxyaceticacid 4CPA）、氯吡脲（forchlorfenuron）、多效唑（paclobutrazol）、2，4二氯苯氧乙酸（2，4dichlorophenoxyacetic）、縮節(jié)胺（mepiquat chloride）、矮壯素（chlormequat chloride），純度均大于96%，德國Dr.Ehrenstorfer。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備。

Waters Xevo TQMS 液質(zhì)聯(lián)用儀，美國Waters公司；勻漿機(jī)，德國IKA公司；氮吹儀，美國Organomation公司；高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司；超聲儀KQ600DE，江蘇昆山市超聲儀器公司；超純水儀，成都超純科技有限公司。

1.2 儀器參數(shù)

1.2.1 色譜條件 。

BEH C18色譜柱（2.1×100 mm，粒徑1.7 μm），柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積5 μl，流動(dòng)相為水-乙腈（梯度洗脫），流速為0.4 ml/min。

1.2.2 質(zhì)譜條件。

電噴霧離子源，正離子/負(fù)離子電離（ESI+/ESI），脫溶劑氣800 L/h，干燥氣溫度400 ℃，錐孔氣50 L/h，離子源溫度150 ℃，在分析過程中，以離子對(duì)（1母離子和2個(gè)子離子）信息比較進(jìn)行定性分析；以母離子和響應(yīng)值最高的子離子進(jìn)行定量分析。8種植物生長調(diào)節(jié)劑在多反應(yīng)監(jiān)測模式下質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.3 樣品處理

稱取5.0 g（精確至0.01 g）葡萄樣品于50 ml離心管中，加入20 ml乙腈，勻漿1 min，超聲提取5 min，再加入2 g氯化鈉，渦旋后離心，取乙腈層，待凈化。將400 mg無水硫酸鎂和100 mg PSA加入上述提取液中，渦旋1 min，離心后準(zhǔn)確移取10 ml上清液至試管中，45 ℃下氮吹至近干，加入1 ml乙腈水溶液（乙腈∶水=2∶8）溶解，渦旋混勻，經(jīng)022 μm濾膜后，在UPLCMS/MS上測定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

8種植物生長調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別精密稱取8種植物生長調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于10 ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1.00 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，再逐步稀釋成工作液。在選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下測定，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，分別得到8種植物生長調(diào)節(jié)劑的線性方程和相關(guān)系數(shù)。計(jì)算3倍信噪時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣品濃度，作為方法的檢出限，10倍信噪時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣品濃度，作為方法的定量限。

1.5 方法回收率及精密度試驗(yàn)

采用對(duì)陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)來考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，即對(duì)本底不含植物生長調(diào)節(jié)劑的陰性葡萄樣品，分別添加3個(gè)水平的8種植物生長調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.3”項(xiàng)下進(jìn)行樣品前處理，在“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件和“1.2.2”項(xiàng)下的質(zhì)譜條件下測定，計(jì)算樣品加標(biāo)回收率。每個(gè)添加水平連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣7 次，測得各組分的峰面積，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇

比較了乙腈、甲醇、乙酸乙酯作為提取溶劑對(duì)葡萄中8種植物生長調(diào)節(jié)劑的提取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈和甲醇對(duì)8種植物生長調(diào)節(jié)劑的提取效率要高于乙酸乙酯，由于樣品本身中含有大量水分，甲醇作為提取劑，在濃縮之前要用大量除水劑除去樣品中的水分，而乙腈作為提取劑只需要在提取后加入少量的氯化鈉，就可以使乙腈和水相分離，因此選乙腈經(jīng)作為提取溶劑。

2.2 色譜條件的選擇

首先比較了甲醇和乙腈分別作為有機(jī)流動(dòng)相，結(jié)果表明，甲醇和乙腈的洗脫能力都比較良好，使用乙腈時(shí)，靈敏度要高于甲醇，這是由于甲醇會(huì)使離子化受到不同程度的抑制。其次比較了水相中加甲酸和不加甲酸，結(jié)果表明，不加甲酸時(shí)，靈敏度要明顯高于加甲酸，是由于在正負(fù)離子同時(shí)檢測時(shí)，加入甲酸會(huì)影響負(fù)離子模式的離子化效率。最后比較了定容液的組成對(duì)各個(gè)組分的影響，由于甲酸對(duì)負(fù)離子的離子化有抑制的作用，所以選擇乙腈水體系作為定容液，同時(shí)比較了乙腈水體系中乙腈和水的組成比例（乙腈和水體積比分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1）對(duì)各個(gè)組分的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈和水體積比為2∶8時(shí)，各組分達(dá)到最大響應(yīng)值。故選擇乙腈和水體積比為2∶8作為最后上機(jī)定容溶液。

2.3 線性相關(guān)性

采用外標(biāo)法定量，在上述儀器條件下進(jìn)行測定，以MS/MS定量離子色譜峰面積（y）對(duì)濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出相應(yīng)的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。8種植物生長調(diào)節(jié)劑在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均在0.99以上。按3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算分別得到8種植物生長調(diào)節(jié)劑的檢出限和定量限，結(jié)果見表2。8種植物生長調(diào)節(jié)劑的檢出限為0.2～0.5 μg/kg，定量限為0.5～1.5 μg/kg。8種生長調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)品總離子流見圖1，加標(biāo)總離子流見圖2。

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

按照“1.5”方法進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)（表3），計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表3中的回收率和RSD數(shù)據(jù)可以看出，樣品在3個(gè)添加水平下8種植物生長調(diào)節(jié)劑的回收率處于73.5%～102.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.9%～9.7%。上述結(jié)果表明，運(yùn)用該方法得到的數(shù)據(jù)是準(zhǔn)確可靠的。結(jié)合前面所述的方法檢出限低的特點(diǎn)可知，該方法能夠從根本上消除檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性的可能性。

2.5 實(shí)際樣品的測定 利用該方法對(duì)新疆維吾爾自治區(qū)3個(gè)批次20個(gè)葡萄樣品進(jìn)行了檢測，其中葡萄中檢出氯吡脲、2，4二氯苯氧乙酸、多效唑、矮壯素，含量在2～10 μg/kg范圍內(nèi)，其他均未檢出，方法適用性良好。8種生長調(diào)節(jié)劑實(shí)際樣品總離子流圖見圖3。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)通過對(duì)提取條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定葡萄中8種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量的方法。該方法前處理簡單、靈敏度高，線性關(guān)系、準(zhǔn)確度和精密度良好，能滿足葡萄中8種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留限量要求，方法適應(yīng)性良好。

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