HPLC法同時測定銀黃顆粒中三種黃酮類成分的含量

于百富+++++陳輝

[摘要] 目的 建立同時測定銀黃顆粒中三種黃酮類成分（黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素）的含量的高效液相色譜方法。 方法 采用Agilent SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇-0.2%甲酸水溶液為流動相，梯度洗脫，流速1.0 ml/min，檢測波長為275 nm，柱溫30℃，進樣量20 μl。 結果 三種成分在建立的方法下分離良好，在考察的濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積之間呈良好的線性關系（r>0.9997）；回收率（n=9）均在94.4%～1a04.7%范圍，RSD均<2.1%。 結論 本方法簡便、準確，精密度高，重復性好，可以用于銀黃顆粒的質(zhì)量控制。

[關鍵詞] 高效液相色譜法；銀黃顆粒；黃酮類成分；含量測定

[中圖分類號] R286 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）07（a）-0053-03

銀黃顆粒是由金銀花和黃芩兩味中草藥提取物組成的復方制劑，具有清熱、利咽、解毒作用。臨床上主要用于治療外感風熱引起的咽干、咽痛、發(fā)熱以及扁桃體炎、急慢性咽炎、上呼吸道感染等多種疾病。黃芩富含多種物質(zhì)，其中含量較高并且具有顯著藥理活性的化合物是黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷等黃酮類化合物[1-7]。銀黃顆粒大多以黃芩苷和綠原酸作為質(zhì)量控制指標[8-11]，監(jiān)測其內(nèi)在質(zhì)量，因這種簡便單一的質(zhì)量控制模式存在一定缺陷，為非法添加埋下了隱患。

中國藥典（2010版）[12]對銀黃顆粒的質(zhì)控是通過測定綠原酸和黃芩苷兩種成分，對這兩種測定成分采用不同的樣品處理方法及色譜條件，步驟繁瑣，且對具有活性成分的黃芩素、漢黃芩苷未進行有效質(zhì)控。

選擇黃芩苷等三種成分作為質(zhì)量控制的指標，可有效地反映銀黃顆粒真正的內(nèi)在質(zhì)量，并為全面評價其質(zhì)量控制提供有效依據(jù)。本試驗以金銀花和黃芩兩種中藥材的已知有效成分為基礎，應用梯度洗脫法構建能同時測定黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素三種化學成分的高效液相色譜法，旨在為銀黃顆粒的內(nèi)在質(zhì)量控制提供更好的依據(jù)。

1 儀器與試劑

美國Agilent 1260高效液相色譜儀系統(tǒng)，AE240電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多）。對照品購于中國藥品生物制品檢定所；銀黃顆粒來自本院和藥店，生產(chǎn)廠家及藥品批次分別為：①云南永安制藥有限責任公司（批號1100303）、②西安交大藥業(yè)（集團）有限責任公司（批號110624）、③河南宛西制藥股份有限責任公司（批號110701）。應用的試劑中，乙腈、甲酸、乙酸、甲醇為色譜純，實驗用水為純化水，其余所用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.2%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫：（A：0～15 min，20%；15～40 min，20%～40%；40～80 min，40%～45%；80～90 min，45%～50%；90～120 min，50%～55%；120～135 min，55%）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：275 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μl。

2.2 供試品溶液的制備

將銀黃顆粒去外包裝，用適當方法研細，精密稱取細粉1.0 g，置于50 ml量瓶中，加入甲醇40 ml，超聲提取20 min（功率350 W，頻率45 KHz），放至室溫，用甲醇稀釋至刻度?；旌暇鶆?，取上清液過濾，即得。

2.3 對照品儲備液的制備

精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素的對照品適量，分別用甲醇溶解稀釋至刻度，配制成濃度為1 mg/ml的對照品儲備溶液，備用。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

分別準確量取適量的各對照品儲備液，置于10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素濃度分別為400.00、100.00、80.00 μg/ml的混合溶液作為對照品。取對照品溶液、供試品溶液，分別測得三種黃酮類成分的混合對照品、樣品溶液的色譜圖（圖1）。通過計算分離度>1.5，理論板數(shù)均>3000。

圖1 275 nm下的HPLC-DAD色譜圖

A.混合對照品，B.銀黃顆粒樣品；1.黃芩苷，2.漢黃芩苷，3.黃芩素

2.5 線性關系的考察、檢出限和定量限

精密吸取混合對照品儲備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，逐步稀釋成一系列不同濃度的對照品溶液，進行測定。以信噪比10∶1求得定量限（LOQ），以信噪比3∶1求得檢出限對照品（LOD）。按規(guī)定色譜條件測定。結果表明三種化合物均有良好的線性關系，定量檢出限（S/N=10）在1.08～1.55 μg/ml（表1）。

表1 三種化合物的回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍和檢出限（n=3）

2.6 精密度試驗

稱取上述實驗已研細的銀黃顆粒細粉1.0 g，精密稱定，按規(guī)定方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，測定黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素的峰面積，結果上述3種黃芩黃酮類成分峰面積的RSD分別為0.68%、0.19%、0.85%，表明該測定方法批內(nèi)精密度良好。取上述實驗已研細的銀黃顆粒細粉1.0 g，精密稱定，按規(guī)定的方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次樣品3批，計算得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素峰面積的RSD分別為1.35%、0.96%、1.59%，表明儀器的批間精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密稱取銀黃顆粒細粉1.0 g，制備成供試品溶液，按2.1同樣色譜條件，分別于0、4、8、12、24 h進樣20 μl測定。通過計算黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素峰面積的RSD分別為1.77%、1.56%、1.81%。表明供試品溶液在室溫下放置24 h銀黃顆粒中的三種被測成分均較穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

精密稱取銀黃顆粒細粉1.0 g，平行制備6份供試品溶液，測定峰面積并計算得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素平均含量分別為50.22、0.43、0.45 mg/g，RSD分別為0.71%、1.44%、1.48%。表明該方法具有良好的重復性。

2.9 加樣回收率試驗

取已測定含量的銀黃顆粒細粉0.5 g共計9份，分別按樣品含量：對照品加入量為（0.5～1.5）∶1的比例加入一定量的對照品溶液，按規(guī)定方法制備實驗用供試品溶液，測定黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素的加樣回收率及RSD。結果上述三種黃芩黃酮類成分，加樣平均回收率分別為106.8%、99.9%、100.5%（表2），表明該方法的準確度良好。

表2 銀黃顆粒中三種黃酮類成分的回收率試驗結果

2.10 樣品含量的測定

分別測定3個不同廠家批號的銀黃顆粒中三種黃酮類化合物的含量，可以看出，生產(chǎn)廠家不同銀黃顆粒中三種被測成分的含量有較大差異（表3），因此建議生產(chǎn)廠家要對批間生產(chǎn)過程進行有效控制，保證其有效成分的含量基本穩(wěn)定。

表3 三批銀黃顆粒中三種化合物的含量測定結果（mg/g，n=3，x±s）

3 討論

3.1 測定波長的選擇

本研究在190～400 nm波長范圍內(nèi)對黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素三種化合物進行了紫外全波長掃描，其分別在277、273、275 nm波長處有最大吸收峰，故選擇275 nm作為測定波長。

3.2 色譜條件的選擇

乙腈和甲醇是常用的液相色譜洗脫劑，通過比較，兩者都可以產(chǎn)生較好的分離效果，但甲醇成本和毒性更低，故選擇甲醇作為洗脫劑。由于黃酮類成分在酸性環(huán)境下能達到更好的峰形，所以在水相中加入0.2%的甲酸，通過優(yōu)化梯度洗脫，最終達到較好的峰形和分離度。

本文構建了銀黃顆粒中三種黃酮類成分含量的測定方法，該方法簡便、準確，精密度高，重復性好，能為銀黃顆粒的全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[參考文獻]

[1] 陳勇川，謝林利，熊麗蓉，等.黃芩苷/黃芩素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗藥性的逆轉(zhuǎn)作用研究[J].中國藥房，2008，19（9）：644-649.

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[10] 張婷，美爾哈巴·熱西提，林瀟，等.HPLC-MS/MS法測定銀黃顆粒中綠原酸和黃芩苷[J].中草藥，2012，43（4）：711-713.

[11] 王玲玲，王凌，楊菲，等.RP-HPLC測定銀黃顆粒中綠原酸和黃芩苷的含量[J].中國試驗方劑學雜志，2012， 18（12）：124-126.

[12] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：84.

（收稿日期：2014-05-26 本文編輯：李亞聰）

2.8 重復性試驗

精密稱取銀黃顆粒細粉1.0 g，平行制備6份供試品溶液，測定峰面積并計算得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素平均含量分別為50.22、0.43、0.45 mg/g，RSD分別為0.71%、1.44%、1.48%。表明該方法具有良好的重復性。

2.9 加樣回收率試驗

取已測定含量的銀黃顆粒細粉0.5 g共計9份，分別按樣品含量：對照品加入量為（0.5～1.5）∶1的比例加入一定量的對照品溶液，按規(guī)定方法制備實驗用供試品溶液，測定黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素的加樣回收率及RSD。結果上述三種黃芩黃酮類成分，加樣平均回收率分別為106.8%、99.9%、100.5%（表2），表明該方法的準確度良好。

表2 銀黃顆粒中三種黃酮類成分的回收率試驗結果

2.10 樣品含量的測定

分別測定3個不同廠家批號的銀黃顆粒中三種黃酮類化合物的含量，可以看出，生產(chǎn)廠家不同銀黃顆粒中三種被測成分的含量有較大差異（表3），因此建議生產(chǎn)廠家要對批間生產(chǎn)過程進行有效控制，保證其有效成分的含量基本穩(wěn)定。

表3 三批銀黃顆粒中三種化合物的含量測定結果（mg/g，n=3，x±s）

3 討論

3.1 測定波長的選擇

本研究在190～400 nm波長范圍內(nèi)對黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素三種化合物進行了紫外全波長掃描，其分別在277、273、275 nm波長處有最大吸收峰，故選擇275 nm作為測定波長。

3.2 色譜條件的選擇

乙腈和甲醇是常用的液相色譜洗脫劑，通過比較，兩者都可以產(chǎn)生較好的分離效果，但甲醇成本和毒性更低，故選擇甲醇作為洗脫劑。由于黃酮類成分在酸性環(huán)境下能達到更好的峰形，所以在水相中加入0.2%的甲酸，通過優(yōu)化梯度洗脫，最終達到較好的峰形和分離度。

本文構建了銀黃顆粒中三種黃酮類成分含量的測定方法，該方法簡便、準確，精密度高，重復性好，能為銀黃顆粒的全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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[8] 黃雄，黃嬛，黃佳，等.HPLC同時測定銀黃顆粒中綠原酸和黃芩苷的含量[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2009，26（5）：417-419.

[9] 白雁，張威，王星，等.近紅外光譜法測定不同廠家銀黃顆粒中黃芩苷含量[J].中國中藥雜志，2010，35（2）：166-168.

[10] 張婷，美爾哈巴·熱西提，林瀟，等.HPLC-MS/MS法測定銀黃顆粒中綠原酸和黃芩苷[J].中草藥，2012，43（4）：711-713.

[11] 王玲玲，王凌，楊菲，等.RP-HPLC測定銀黃顆粒中綠原酸和黃芩苷的含量[J].中國試驗方劑學雜志，2012， 18（12）：124-126.

[12] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：84.

（收稿日期：2014-05-26 本文編輯：李亞聰）

2.8 重復性試驗

精密稱取銀黃顆粒細粉1.0 g，平行制備6份供試品溶液，測定峰面積并計算得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素平均含量分別為50.22、0.43、0.45 mg/g，RSD分別為0.71%、1.44%、1.48%。表明該方法具有良好的重復性。

2.9 加樣回收率試驗

取已測定含量的銀黃顆粒細粉0.5 g共計9份，分別按樣品含量：對照品加入量為（0.5～1.5）∶1的比例加入一定量的對照品溶液，按規(guī)定方法制備實驗用供試品溶液，測定黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素的加樣回收率及RSD。結果上述三種黃芩黃酮類成分，加樣平均回收率分別為106.8%、99.9%、100.5%（表2），表明該方法的準確度良好。

表2 銀黃顆粒中三種黃酮類成分的回收率試驗結果

2.10 樣品含量的測定

分別測定3個不同廠家批號的銀黃顆粒中三種黃酮類化合物的含量，可以看出，生產(chǎn)廠家不同銀黃顆粒中三種被測成分的含量有較大差異（表3），因此建議生產(chǎn)廠家要對批間生產(chǎn)過程進行有效控制，保證其有效成分的含量基本穩(wěn)定。

表3 三批銀黃顆粒中三種化合物的含量測定結果（mg/g，n=3，x±s）

3 討論

3.1 測定波長的選擇

本研究在190～400 nm波長范圍內(nèi)對黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素三種化合物進行了紫外全波長掃描，其分別在277、273、275 nm波長處有最大吸收峰，故選擇275 nm作為測定波長。

3.2 色譜條件的選擇

乙腈和甲醇是常用的液相色譜洗脫劑，通過比較，兩者都可以產(chǎn)生較好的分離效果，但甲醇成本和毒性更低，故選擇甲醇作為洗脫劑。由于黃酮類成分在酸性環(huán)境下能達到更好的峰形，所以在水相中加入0.2%的甲酸，通過優(yōu)化梯度洗脫，最終達到較好的峰形和分離度。

本文構建了銀黃顆粒中三種黃酮類成分含量的測定方法，該方法簡便、準確，精密度高，重復性好，能為銀黃顆粒的全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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[8] 黃雄，黃嬛，黃佳，等.HPLC同時測定銀黃顆粒中綠原酸和黃芩苷的含量[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2009，26（5）：417-419.

[9] 白雁，張威，王星，等.近紅外光譜法測定不同廠家銀黃顆粒中黃芩苷含量[J].中國中藥雜志，2010，35（2）：166-168.

[10] 張婷，美爾哈巴·熱西提，林瀟，等.HPLC-MS/MS法測定銀黃顆粒中綠原酸和黃芩苷[J].中草藥，2012，43（4）：711-713.

[11] 王玲玲，王凌，楊菲，等.RP-HPLC測定銀黃顆粒中綠原酸和黃芩苷的含量[J].中國試驗方劑學雜志，2012， 18（12）：124-126.

[12] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：84.

（收稿日期：2014-05-26 本文編輯：李亞聰）