HPLC同時測定余甘子葉中槲皮素和山奈酚的含量

毛健++++劉振杰

[摘要] 目的 建立HPLC同時測定余甘子葉中槲皮素和山奈酚含量的方法。 方法 色譜柱：Thermo Hypersil BDS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），梯度洗脫流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液，流速：1.0 ml/min，檢測波長：370 nm，柱溫：30℃，進樣體積：20 μl。 結(jié)果 槲皮素和山奈酚分別在0.003～0.06 μg/μl（r=0.9995）、0.001015～0.0203 μg/μl（r=0.9993）范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率（n=6）分別為98.83%（RSD=2.73%）、101.58%（RSD=2.21%）。 結(jié)論 建立了同時測定槲皮素和山奈酚含量的方法，可進一步完善余甘子葉的質(zhì)量控制體系。

[關(guān)鍵詞] HPLC；余甘子葉；槲皮素；山奈酚

[中圖分類號] R282 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）07（a）-0050-03

余甘子（Phyllanthus emblica L.）是大戟科（Euphorbiaceae）葉下珠屬（Phyllanthus）植物，是一味重要的傳統(tǒng)民族藥，已被載入多版中國藥典[1]。余甘子不僅果實可入藥，其種子、根、莖、葉、花亦可入藥，如葉用于治療水腫、皮膚濕疹、蛇咬傷、蜈蚣咬傷等[2-3]。隨著藥理學(xué)研究的展開，余甘子在抗菌[4]、抗腫瘤[5]、抗氧化[6]、抗動脈粥樣硬化[7-8]、抗乙型肝炎病毒[9]、保肝[10]、增強免疫[11-12]等方面的作用得到了進一步的認識。余甘子有多種化學(xué)成分，其中槲皮素和山奈酚為余甘子葉的活性成分[13]，本研究建立同時測定余甘子葉中槲皮素和山奈酚含量的方法，以期為進一步完善余甘子葉的質(zhì)量控制體系提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜儀：型號Agilent1100（含在線真空脫氣機、高壓四元梯度泵、標準自動進樣器、智能化柱溫箱、可變波長檢測器、二極管陣列檢測器）；Series色譜工作站（美國安捷倫科技公司）；SB3200T超聲波清洗儀（上海能信超聲有限公司）；LG16-W高速微量離心機（美國醫(yī)用離心機廠）；BP211D電子分析天平（德國賽多利斯）；Millipore Simplicity-185超純水器（美國密理博公司）。

1.2 試劑

槲皮素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100081-200406）；山奈酚對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：11081-200405）。余甘子葉樣品經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院藥用植物教研室劉壽養(yǎng)副教授鑒定。乙腈為色譜純，水為高純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 實驗條件的設(shè)定

色譜柱：Thermo Hypersil BDS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速：1.0 ml/min，檢測波長：370 nm，柱溫：30℃，進樣量：20 μl/次，梯度洗脫流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫程序見表1。理論塔板數(shù)以槲皮素和山奈酚峰計算應(yīng)≥3000，分離度應(yīng)>1.5，在此色譜條件下，樣品分離良好，結(jié)果見圖1。

表1 梯度洗脫時間程序表

圖1 余甘子葉的HPLC色譜圖

A.槲皮素峰；B.山奈酚峰

2.2 標準對照品溶液的制備

取槲皮素對照品約0.60 mg，精密稱定，置于10 ml具塞容量瓶中，加100%甲醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，即得臨時溶液。取山奈酚對照品1.02 mg，精密稱定，置于50 ml具塞容量瓶中，精密加入上述臨時溶液1 ml，加甲醇溶解至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末約1 g，精密稱定，置50 ml錐形瓶中，精密加入25 ml甲醇，稱重，超聲處理45 min，冷卻，用甲醇補足損失的重量，再用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系的考察

取前述的標準對照品溶液5份，體積分別為0.5、2、4、8、10 ml；分別置于各自的10 ml容量瓶中，分別加甲醇至刻度，搖勻。吸取上述各溶液及2.2項下制備的標準對照品溶液各10 μl，按2.1項下的實驗條件，注入色譜儀，進行測定。以峰面積Y作為縱坐標，進樣濃度量X（μg/μl）作為橫坐標繪制標準工作曲線，進行線性回歸：槲皮素Y=3342X-17.70，r=0.9995；山奈酚Y=2986X-7.10，r=0.9993，線性范圍分別槲皮素0.003～0.06 μg/μl，山奈酚0.001015～0.0203 μg/μl。

2.5 精密度試驗

取2.2項下的標準對照品溶液20 μl，連續(xù)進樣6次，對槲皮素和山奈酚的峰面積進行考察，其RSD分別為0.4%（n=6）、0.4%（n=6），所得結(jié)果顯示所用儀器精密度好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液20 μl于同一天分別在0、1、2、4、6、12 h不同時間間隔點按選定的含量測定方法測定槲皮素和山奈酚，對所得的峰面積進行統(tǒng)計考察，其RSD分別為1.8%（n=6）、1.2%（n=6），試驗結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批樣品6份各1 g，分別按前述方法制備成供試品溶液，按選定方法測定槲皮素和山奈酚的含量，結(jié)果槲皮素和山奈酚平均含量分別為0.6313、0.1159 mg/g，RSD值分別為1.7%（n=6）、2.1%（n=6）。

2.8 加樣回收率試驗

本實驗采用標準添加法測定回收率：精密稱定槲皮素和山奈酚各6份0.5 g（樣品含量已知），分別精密加入甲醇15 ml，再精密加入前述配制的標準對照品溶液5 ml，其余操作按照2.3項下方法制備，并進樣檢測含量，結(jié)果見表2和表3。

表2 槲皮素加樣回收率測定結(jié)果

表3 山奈酚加樣回收率測定結(jié)果

2.9 樣品測定

取樣品粉末，按2.3項下方法制備各供試品溶液。按2.1項下條件進行測定，每個樣品重復(fù)測定3次，外標法計算各樣品中槲皮素和山奈酚的含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

本實驗采用的檢測波長是在對對照品溶液進行紫外光譜掃描考察后，發(fā)現(xiàn)在370 nm處有較大的吸收，干擾較小，靈敏度較高，故選定檢測波長為370 nm。

本實驗還對流動相的選擇進行了實驗考察研究，遴選過乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-水等多種溶液系統(tǒng)作為流動相，其中以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相梯度洗脫的分離效果最好，因此選定該溶液作為含量測定的流動相。

本文比較了3個產(chǎn)地的余甘子葉中槲皮素和山奈酚的含量，其中槲皮素的含量以廣西壯族自治區(qū)恭城縣（0.6317 mg/g）最高，廣西壯族自治區(qū)欽州市（0.1234 mg/g）的含量較低；其中山奈酚的含量以廣西壯族自治區(qū)恭城縣（0.1172 mg/g）最高，廣西壯族自治區(qū)欽州市（0.03249 mg/g）的含量較低。

本實驗建立了高效液相色譜法同時測定余甘子葉中槲皮素和山奈酚含量的方法，經(jīng)方法學(xué)考察顯示，該定量檢測方法簡便、準確、快速，穩(wěn)定可行，重復(fù)性好，可作為控制余甘子葉質(zhì)量的方法，也為評價余甘子葉質(zhì)量提供了參考依據(jù)。

[參考文獻]

[1] 衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：167.

[2] 周濤，邱德文.民族藥余甘子的本草藥學(xué)概況[J].貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2002，24（3）：3.

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[6] 潘國慶，趙旭升，蔣炘治.余甘子抗氧化作用的研究[J].青海科技，2007，12（6）：33.

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[9] 黃正昌，鄧學(xué)龍，朱宇同，等.臺灣細葉油柑體內(nèi)外抗乙肝病毒作用研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2000，17（3）：260.

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[11] 羅春麗.余甘子對腫瘤細胞抑制作用及免疫調(diào)節(jié)的研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（13）：155.

[12] 崔炳權(quán)，何震宇，楊澤民，等.余甘子提取物對小鼠免疫功能的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21（8）：1920.

[13] 梁臣艷，甄漢深，劉振杰，等.廣西余甘子葉醋酸乙酯部位化學(xué)成分的研究[J].中成藥，2009，31（5）：761.

（收稿日期：2014-05-12 本文編輯：李亞聰）

表2 槲皮素加樣回收率測定結(jié)果

表3 山奈酚加樣回收率測定結(jié)果

2.9 樣品測定

取樣品粉末，按2.3項下方法制備各供試品溶液。按2.1項下條件進行測定，每個樣品重復(fù)測定3次，外標法計算各樣品中槲皮素和山奈酚的含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

本實驗采用的檢測波長是在對對照品溶液進行紫外光譜掃描考察后，發(fā)現(xiàn)在370 nm處有較大的吸收，干擾較小，靈敏度較高，故選定檢測波長為370 nm。

本實驗還對流動相的選擇進行了實驗考察研究，遴選過乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-水等多種溶液系統(tǒng)作為流動相，其中以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相梯度洗脫的分離效果最好，因此選定該溶液作為含量測定的流動相。

本文比較了3個產(chǎn)地的余甘子葉中槲皮素和山奈酚的含量，其中槲皮素的含量以廣西壯族自治區(qū)恭城縣（0.6317 mg/g）最高，廣西壯族自治區(qū)欽州市（0.1234 mg/g）的含量較低；其中山奈酚的含量以廣西壯族自治區(qū)恭城縣（0.1172 mg/g）最高，廣西壯族自治區(qū)欽州市（0.03249 mg/g）的含量較低。

本實驗建立了高效液相色譜法同時測定余甘子葉中槲皮素和山奈酚含量的方法，經(jīng)方法學(xué)考察顯示，該定量檢測方法簡便、準確、快速，穩(wěn)定可行，重復(fù)性好，可作為控制余甘子葉質(zhì)量的方法，也為評價余甘子葉質(zhì)量提供了參考依據(jù)。

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（收稿日期：2014-05-12 本文編輯：李亞聰）

表2 槲皮素加樣回收率測定結(jié)果

表3 山奈酚加樣回收率測定結(jié)果

2.9 樣品測定

取樣品粉末，按2.3項下方法制備各供試品溶液。按2.1項下條件進行測定，每個樣品重復(fù)測定3次，外標法計算各樣品中槲皮素和山奈酚的含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

本實驗采用的檢測波長是在對對照品溶液進行紫外光譜掃描考察后，發(fā)現(xiàn)在370 nm處有較大的吸收，干擾較小，靈敏度較高，故選定檢測波長為370 nm。

本實驗還對流動相的選擇進行了實驗考察研究，遴選過乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-水等多種溶液系統(tǒng)作為流動相，其中以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相梯度洗脫的分離效果最好，因此選定該溶液作為含量測定的流動相。

本文比較了3個產(chǎn)地的余甘子葉中槲皮素和山奈酚的含量，其中槲皮素的含量以廣西壯族自治區(qū)恭城縣（0.6317 mg/g）最高，廣西壯族自治區(qū)欽州市（0.1234 mg/g）的含量較低；其中山奈酚的含量以廣西壯族自治區(qū)恭城縣（0.1172 mg/g）最高，廣西壯族自治區(qū)欽州市（0.03249 mg/g）的含量較低。

本實驗建立了高效液相色譜法同時測定余甘子葉中槲皮素和山奈酚含量的方法，經(jīng)方法學(xué)考察顯示，該定量檢測方法簡便、準確、快速，穩(wěn)定可行，重復(fù)性好，可作為控制余甘子葉質(zhì)量的方法，也為評價余甘子葉質(zhì)量提供了參考依據(jù)。

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[10] 李萍，謝金鮮，林啟云.民族藥余甘子對D-半乳糖胺所致小鼠急性肝損傷的影響[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志，2003，12（3）：161.

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[12] 崔炳權(quán)，何震宇，楊澤民，等.余甘子提取物對小鼠免疫功能的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21（8）：1920.

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（收稿日期：2014-05-12 本文編輯：李亞聰）