褥瘡冰蜜濕敷劑中組方藥的抗菌實驗研究

饒軍英，韓志，金必成，張耀勇，周燕

(1.貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 骨一科，貴州 貴陽 550003；2.貴州電力職工醫(yī)院 外科，貴州 貴陽 550002)

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褥瘡冰蜜濕敷劑中組方藥的抗菌實驗研究

饒軍英1，韓志1，金必成2，張耀勇1，周燕1

(1.貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 骨一科，貴州 貴陽 550003；2.貴州電力職工醫(yī)院 外科，貴州 貴陽 550002)

目的 探討褥瘡冰蜜濕敷劑中冰片、蜂蜜、慶大霉素注射液不同組方的抗菌效果。方法 用金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S. aureus)、大腸埃希菌(Escherichiacoli，E. coli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，P. aeruginosa)分別制作兔三期感染褥瘡模型，以凡士林為對照組，分別用蜂蜜+冰片、蜂蜜+慶大霉素，冰片+慶大霉素，冰片+慶大霉素+蜂蜜制成換藥紗布治療褥瘡，取治療前后組織做菌種鑒定及菌落計數(shù)觀察。結果 治療后蜂蜜+冰片、蜂蜜+慶大霉素、冰片+慶大霉素與冰片+慶大霉素+蜂蜜組S. aureus、E.coli、P.aeruginosa菌落計數(shù)均顯著低于治療前(P<0.05)。治療后4個組方組S. aureus、E.coli、P.aeruginosa菌落計數(shù)均顯著低于凡士林組(P<0.05)。治療后，冰片+慶大霉素+蜂蜜(原方)組S. aureus、E.coli、P.aeruginosa菌落計數(shù)顯著低于蜂蜜+冰片、蜂蜜+慶大霉素、冰片+慶大霉素組(P<0.05)。結論 濕敷劑中冰片+慶大霉素+蜂蜜(原方)抗菌作用最優(yōu)。

褥瘡冰蜜濕敷劑；組方；褥瘡；抗菌

本研究旨在對蜂蜜+冰片、蜂蜜+慶大霉素，冰片+慶大霉素，冰片+慶大霉素+蜂蜜4個組方進行抗菌實驗研究，分別用金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸埃希菌(E.coli)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)3個菌種構建大白兔三期感染褥瘡模型。通過治療前后對炎性組織中細菌的形態(tài)特征做菌種鑒定(identification of bacteria)，用瓊脂培養(yǎng)基和菌落計數(shù)器統(tǒng)計其菌落計數(shù)(colony-forming units，CFU)，比較4個組方的抗菌作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 日本大耳兔，90只，雄性，15～20周齡，體質量2.8～3 kg，購自貴陽醫(yī)學院試驗動物中心，動物合格證號：SCXK(黔)2012-0001。適應性飼養(yǎng)7d后，隨機分為5組，凡士林組、蜂蜜+冰片、蜂蜜+慶大霉素、冰片+慶大霉素、冰片+慶大霉素+蜂蜜組；每組18只大白兔，每組分為3個亞組，分別使用金黃色葡萄球菌組，大腸埃希菌組，銅綠假單胞菌組制作三期感染褥瘡動物模型，每個亞組6只大白兔。

1.2 藥物 蜂蜜300 g(湖北省定州市北方科技養(yǎng)蜂廠)，冰片50g，硫酸慶大霉素注射液40 mL(共160萬U，8萬U/2 mL/支，光正制藥有限公司提供)，生理鹽水160 mL(用于濕潤紗布，幫助冰片粘附，稀釋慶大霉素；本院藥劑科提供研為細粉的冰片、凡士林紗布。

1.3 菌種 金黃色葡萄球菌ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922標準菌株(上海坤肯生物化工有限公司)。

1.4 儀器 Scan300全自動菌落計數(shù)儀(上海智理科學儀器有限公司)，F(xiàn)YL-YS-100L 37 ℃恒溫箱(Olympus)，BX51光學顯微鏡(蘇州易微光學有限公司)，XW-80A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠)，JB5374-19電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)。

1.5 方法

1.5.1 菌液制備：分別將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌標準菌株加入1 mL肉湯中，混勻，接種血平板，37°恒溫孵育箱培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況，菌落用生理鹽水調成0.5麥氏單位，配制菌液，放置4 ℃～7 ℃保溫桶中2 h內接種。

1.5.2 濕敷劑紗布制備：高溫將5個搪瓷容器消毒，分別裝：凡士林紗布(對照組)，蜂蜜300 g+冰片50 g+生理鹽水100 mL，冰片50 g+慶大霉素40 mL+生理鹽水160 mL，蜂蜜300g+慶大霉素40 mL+生理鹽水160 mL，蜂蜜300 g+冰片50 g+慶大霉素40 mL+生理鹽水160 mL。除對照組，其余均加入相同重量的消毒紗布50 g，充分混勻，制成不同組方含藥紗布，含冰片組加生理鹽水為了潤濕紗布，以增加冰片的粘附性，含慶大霉素組加生理鹽水，為了等量稀釋作用，配制完畢置常溫備用。

1.5.3 造模方法：采用改良付小兵全層皮膚缺損法[4]制成創(chuàng)傷感染性動物三期褥瘡模型，用電子天平稱12枚2～3 g無菌棉球分別植于6只實驗用大白兔兩側臀部皮下，3副5 mL消毒空針分別抽吸以上配制的菌液4 mL從傷口處浸濕棉球，縫合皮膚，種植前常規(guī)脫毛，消毒，觀察5～8 d，待局部紅腫全層皮膚破潰，潰瘍形成后取出棉球，若皮下脂肪組織外露，可見膿性分泌物，三期感染褥瘡即可形成。相同方法在5組動物模型中進行。

需要與誘因統(tǒng)合而成動機。對工科新教師而言，培訓的需要有兩個來源：其一，來自于新教師內心深處成為一名好教師的渴求；其二，來源于學生、學校、社會對其成為一名好教師的期待?；诖?，激發(fā)工科新教師對培訓的強烈需要，其基本策略有如下幾點。

1.5.4 炎性標本制作：在三期感染褥瘡生成但未治療的傷口內取3個感染褥瘡標本，電子天平稱取每個標本重1 g，作為第一次標本。隔日換藥1次，用生理鹽水沖洗傷口(禁用消毒藥水)，單層上述制備的濕敷劑紗布及6層消毒干紗布覆蓋創(chuàng)面，換藥3次后的第2天，分別為每個創(chuàng)面取3個1 g檢測標本作為第二次標本。

1.6 指標檢測

1.6.1 細菌鑒定：將所取2組標本1 g放入盛有5 mL生理鹽水的無菌器皿中，旋渦混合器將標本和生理鹽水充分混勻，取1 mL加肉湯2 mL增菌，接種血平板，37 ℃恒溫孵育箱培養(yǎng)24 h，肉眼觀察菌落形態(tài)，挑起菌落涂片，行革蘭氏染色，100倍油鏡下觀察細菌形態(tài)，用菌落計數(shù)儀確定是否為已種植的標準菌株，確定細菌是否種植成功。

1.6.2 菌落計數(shù)：同時取上述混勻后的含菌溶液用定量接種環(huán)取10 μL溶液接種血平板，37 ℃恒溫孵育箱培養(yǎng)24 h后計數(shù)，讀取血平板上菌落數(shù)，若所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù)，則將所取標本1 g放入盛有10 mL或20 mL生理鹽水的無菌器皿中增加稀釋倍數(shù)，旋渦混合器充分混勻，若連續(xù)2個稀釋度的平板菌落數(shù)在30 CFU～300 CFU時，確定此2個菌落數(shù)的平均值。用公式N=∑C/(n1+0.1n2)d計算出每毫升標本的菌落總數(shù)，N-樣品中菌落數(shù)(單位：CFU)，ΣC-平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和，n1-第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))平板個數(shù)，n2-第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))平板個數(shù)，d-稀釋因子(第一稀釋度)，若細菌種植不成功，則此例標本不納入統(tǒng)計。

2 結果

與治療前比較，治療后蜂蜜+冰片、蜂蜜+慶大霉素、冰片+慶大霉素與冰片+慶大霉素+蜂蜜組S. aureus、E.coli、P.aeruginosa菌落計數(shù)均顯著降低(P<0.05)。與凡士林組比較，治療后4個組方組S. aureus、E.coli、P.aeruginosa菌落計數(shù)均顯著降低(P<0.05)。治療后，冰片+慶大霉素+蜂蜜(原方)組S. aureus、E.coli、P.aeruginosa菌落計數(shù)顯著低于蜂蜜+冰片、蜂蜜+慶大霉素、冰片+慶大霉素組(P<0.05)。見表1。

表1 不同組方治療前后標本菌落計數(shù)Tab.1 Comparison of colony count pre-treatment and post-treatment of each ±s，CFU/mL，n=12)

#P<0.05，與治療前比較，compared with pre-treatment；*P<0.05，與凡士林組比較，compared with vaseline group；△P<0.05，與冰片+慶大霉素+蜂蜜組比較，compared with borneol+ gentamicin+honey

3 討論

褥瘡即為壓瘡，又稱壓力性潰瘍，由于局部組織長期受壓，發(fā)生持續(xù)缺血、缺氧、營養(yǎng)不良而致組織潰爛壞死，根據(jù)美國全國壓瘡顧問小組2007年最新臨床分類，分為以下四期：第一期壓瘡：淤血紅潤期——“紅、腫、熱、痛或麻木，持續(xù)30 min不退”在骨隆突處的皮膚完整伴有壓之不褪色的局限性紅斑。第二期壓瘡：炎性浸潤期——“紫紅、硬結、疼痛、水皰”，真皮部分缺失，表現(xiàn)為一個淺的開放性潰瘍，無組織壞死，也可能表現(xiàn)為一個完整的或破裂的血清性水皰。第三期：壓瘡淺度潰瘍期——表皮破損、潰瘍形成，全層皮膚組織缺失，可見皮下脂肪暴露，但骨頭、肌腱、肌肉未外露，傷口內有壞死組織。第四期：壓瘡壞死潰瘍期——真皮下組織壞死，感染擴散至肌肉層、骨面，常有全層組織缺失，伴有骨、肌腱或肌肉外露，常有潛行隧道。本實驗用大白兔三期感染褥瘡作為動物模型，對濕敷劑的抗菌作用進行了組方藥的抗菌作用研究，為濕敷劑的臨床應用提供了抗菌實驗依據(jù)，由此可見，濕敷劑可以廣泛用于臨床開放性損傷及感染傷口的常規(guī)換藥敷料，能有效縮短療程，減少全身抗生素的應用。

冰片：天然冰片又稱天然右旋龍腦，是為數(shù)不多的具有明確化學結構的藥物之一。在長期的臨床用藥經(jīng)驗中，冰片常作為一種佐使藥物使用發(fā)揮促透作用[4]；能使皮膚角質細胞疏松、細胞間隙增大、毛囊口孔徑加寬等，有促進藥物吸收的功效[5]，冰片在中藥方劑中常作為佐使藥和引藥，與藥物歸經(jīng)有關。冰片具有促進血腦屏障的生理性開放作用，部分原因可能與抑制P-gp的功能有關。體外研究表明，冰片對狗腎細胞系(medin-darby canine kidney，MDCK)細胞膜上P-gp的活性具有抑制作用，冰片與丹酚酸B聯(lián)合應用可以顯著抑制血腦屏障腦微血管內皮細胞MDR1 mRNA的表達，進而可能降低P-gp的功能性表達[6-7]，冰片本身極易通過血腦屏障進入腦內，還可促進BBB的生理性開放，使順鉑、慶大霉素、川芎嗪等藥物易于透過血腦屏障進入腦內[8]。長期以來對冰片的應用顯示其具有許多的藥理活性及作用：鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌等[9]。

蜂蜜：蜂蜜是工蜂將采集的植物花蜜或分泌物經(jīng)過充分釀造而貯存在蜂巢內的甜味物質，它是一種粘度高、透明或半透明的液體。蜂蜜不僅具有很高的營養(yǎng)價值，而且還具有多種生物學活性，如抗氧化、解毒、抗菌、消炎、滋潤、防腐、保護創(chuàng)面、促進細胞再生等[10]。有研究發(fā)現(xiàn)[11]，蜂蜜對60多種細菌以及7種真菌有抑菌作用，其中對炭疽桿菌、短小芽孢桿菌、白喉狀桿菌、大腸桿菌、肺炎桿菌等均有明顯的殺菌作用；蜂蜜對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌有明顯的抑菌作用[12]，蜂蜜除含65%～80%的葡萄糖及果糖外，還含有豐富的酶、維生素和礦物質，大于60 ℃會破壞酶等營養(yǎng)成分，故臨床配制的濕敷劑禁止高溫滅菌消毒。單味蜂蜜對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌無抗菌作用；其高滲透性，能使細菌脫水死亡，天然蜂蜜為酸性，不利于細菌生長，從而起抗菌作用[13]。

慶大霉素：主要用于大腸桿菌、痢疾桿菌、克雷伯肺炎桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌等革蘭陰性菌引起的系統(tǒng)或局部感染(對中樞感染無效)[14]。

治療后蜂蜜+冰片、蜂蜜+慶大霉素抗菌效果顯著優(yōu)于冰片+慶大霉素與冰片+慶大霉素+蜂蜜組S. aureus、E.coli、P.aeruginosa菌落計數(shù)均顯著降低(P<0.05)。與凡士林組比較，治療后4個組方組S. aureus、E.coli、P.aeruginosa菌落計數(shù)均顯著降低(P<0.05)。治療后，冰片+慶大霉素+蜂蜜(原方)組S. aureus、E.coli、P.aeruginosa菌落計數(shù)顯著低于蜂蜜+冰片、蜂蜜+慶大霉素、冰片+慶大霉素組(P<0.05)。

本研究結果顯示，治療后冰片+慶大霉素+蜂蜜抗菌效果顯著優(yōu)于冰片+慶大霉素，說明蜂蜜能通過其高滲透壓及酸性環(huán)境，降低細菌活性，達到抑菌的作用，從而提高冰片及慶大霉素的抗菌作用(P<0.05)。治療后冰片+慶大霉素+蜂蜜抗菌效果顯著優(yōu)于蜂蜜+慶大霉素，說明在組方中的冰片促進藥物吸收，故增強了組方的抗菌作用。

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(編校：王儼儼)

Experimental study of antimicrobial formulas in wet honey ice bedsores

RAO Jun-ying1, HAN Zhi1, JIN Bi-cheng2, ZHANG Yao-yong1, ZHOU Yan1

(1.Department of Orthopedics, The Second Affiliated Hospital of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550003, China; 2. Department of Surgery, Guizhou Electric Power Worker’s Hospital, Guiyang 550002, China)

ObjectiveTo study antibacterial effect of formulas, borneol, honey, gentamicin in wet honey ice bedsores. MethodsThe third-stage infective bedsore model in rabbit were estabished withStaphylococcusaureus(S.aureus),Escherichiacoli(E.coli), andPseudomonasaeruginosa(P.aeruginosa). The rabbits with bedsore were respectively compressed with gauze of honey+borneol, honey+gentamicin,borneol+gentamicin,borneol+gentamicin+honey, vaseline as control group. The strain identification and colony counts were observed before and after treatment. ResultsThe colony count ofS. aureus,E.coli andP.aeruginosa in honey+borneol, honey+gentamicin, borneol+gentamicin, borneol+gentamicin+honey post-treatment was significantly higher than that of pre-treatment, respectively (P<0.05). The colony count of three strains in above four formulas post-treatment was significantly lower than that in vaseline group, respectively (P<0.05). The colony count of three strains in borneol+gentamicin+honey (original formula) post-treatment was significantly lower than that in the other formulas, respectively (P<0.05). ConclusionThe antibacterial effect of borneol+gentamicin+honey (original formula) is the best.

wet honey ice bedsores; formulas; bedsore; colony count; rabbit

貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學技術科研項目(QZYY2012-19)

饒軍英，女，本科，副主任醫(yī)師，碩士研究生導師，研究方向：骨科臨床及中藥在骨科臨床的應用研究，E-mail：raojunying1964@163.com。

R47

A

1005-1678(2015)08-0052-03