HPLC法同時測定脈絡寧注射液中哈巴苷和哈巴俄苷的含量

周長凱，高靜，史士強，郝麗萍，荊凡波Δ

(1.青島大學附屬醫(yī)院 藥劑科，山東 青島 266100；2.青島市第三人民醫(yī)院 藥劑科，山東 青島 266041)

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HPLC法同時測定脈絡寧注射液中哈巴苷和哈巴俄苷的含量

周長凱1，高靜2，史士強1，郝麗萍1，荊凡波1Δ

(1.青島大學附屬醫(yī)院 藥劑科，山東 青島 266100；2.青島市第三人民醫(yī)院 藥劑科，山東 青島 266041)

目的 建立脈絡寧注射液中哈巴苷和哈巴俄苷的含量檢測方法。方法 采用高效液相色譜法對脈絡寧注射液中哈巴苷和哈巴俄苷的含量進行檢測，色譜條件為：色譜柱為SunfireTMC18柱(4.6 mm×15 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.03%磷酸水溶液梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm。結果 哈巴苷在0.1424～0.8544 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好(r=0.9998)，平均回收率98.22%，RSD=1.46%(n=6)，哈巴俄苷在0.0732～0.4392 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好(r=0.9997)，平均回收率99.27%，RSD=1.42%(n=6)。結論 該法操作簡便，準確可靠，可作為脈絡寧注射液中哈巴苷和哈巴俄苷的含量測定方法。

脈絡寧注射液；哈巴苷；哈巴俄苷；含量測定；高效液相色譜法

脈絡寧注射液由金銀花、玄參、牛膝、石斛組成，具有清熱養(yǎng)陰、活血化瘀的功效，用于治療血栓閉塞性脈管炎、靜脈血栓形成、動脈硬化性閉寒癥、腦血栓形成及其后遺癥等[1]。其作用機制與抗凝、溶栓、解痙、止痛、擴張血管、改善微循環(huán)以及抗自由基等有關。脈絡寧注射液已有20余年的生產(chǎn)經(jīng)驗，有較高的市場占有率，在防治各種急、慢性心腦血管等疾病中具有起效快、療效好、不良反應少等優(yōu)點[2]。

組方藥材玄參系玄參科植物玄參(ScrophularianingpoensisHemsl.)的干燥根，具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結的功效。主治身熱煩渴、咽喉腫痛、瘰疬痰核、癰疽瘡毒等癥。玄參中含有多種環(huán)烯醚萜苷類成分，其中哈巴苷和哈巴俄苷含量最高。藥理研究發(fā)現(xiàn)哈巴苷和哈巴俄苷具有較強的抗炎、神經(jīng)保護、增強免疫等作用，為玄參的特征性有效成分[3]。2010年版《中國藥典》以哈巴苷和哈巴俄苷的含量作為玄參藥材的質(zhì)量控制標準[4]。目前未見脈絡寧注射液中哈巴苷和哈巴俄苷含量測定的報道，本文旨在采用高效液相色譜同時測定脈絡寧注射液中哈巴苷和哈巴俄苷的含量，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供快速、準確的測定方法。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 3批脈絡寧注射液(金陵藥業(yè)股份有限公司，批號分別為20150109、20150110、20150111)；哈巴苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：111729-200907)；哈巴俄苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：111730-200903)；乙腈(美國Fisher公司，色譜純)；娃哈哈純凈水；其他為分析純(北京高華偉業(yè)化學品有限責任公司)。

1.2 儀器 Waters 2690高效液相色譜系統(tǒng)，包括四元高壓梯度泵系統(tǒng)，2998型PDA檢測器，柱溫控制系統(tǒng)，自動進樣系統(tǒng)(美國Waters公司)；Sartorius BP211D電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件：色譜柱：SunfireTMC18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.03%磷酸水溶液溶梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：35 ℃。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Conditions of gradient elution

1.3.2 對照品溶液制備：分別精密稱取哈巴苷對照品7.12 mg、哈巴俄苷對照品3.66 mg于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別制成每1 mL含哈巴苷0.712 mg、哈巴俄苷0.366 mg的溶液，作為對照品溶液。精密量取對照品溶液各1 mL，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL分別含哈巴苷0.0712 mg、哈巴俄苷0.0366 mg的混合溶液，精密吸取上述混合對照品溶液2、4、6、8、10、12 μL，按上述色譜條件，分別進樣，測定。

1.3.3 供試品溶液制備：精密量取脈絡寧注射液2 mL至10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.4 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.3.4 系統(tǒng)適應性：依上述色譜條件，精密吸取混合對照品溶液10 μL、供試品溶液20 μL，分別進樣。

1.3.5 線性關系考察：精密吸取混合對照品溶液(每1 mL分別含哈巴苷0.071 μg、哈巴俄苷0.0366 μg)各2、4、6、8、10、12 μL，注入液相色譜儀，測定色譜峰峰面積。

1.3.6 精密度考察 取脈絡寧注射液供試品溶液，重復進樣6次，每次20 μL，注入液相色譜儀，測定色譜峰峰面積。

1.3.7 重復性考察：取同一批樣品6份，按“1.3.3 供試品溶液制備”項下方法制備供試品溶液，測定哈巴苷、哈巴俄苷色譜峰峰面積，計算含量。

1.3.8 穩(wěn)定性考察：取脈絡寧注射液供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣每次20 μL，測定哈巴苷、哈巴俄苷色譜峰峰面積。

1.3.9 回收率試驗：精密量取已知含量的脈絡寧注射液1 mL(含哈巴苷3.175 g/L，哈巴俄苷0.4182 g/L)6份，置100 mL容量瓶中，分別精密添加一定量的對照品溶液，按“1.3.3供試品溶液制備”項下方法制得供試品溶液，分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算哈巴苷和哈巴俄苷的加樣回收率。

1.4 樣品含量測定：分別取3批脈絡寧注射液，按“1.3.3 供試品溶液制備”項下方法制備供試品，按“1.3.1 色譜條件”項下色譜條件測定，采用外標一點法計算哈巴苷、哈巴俄苷的含量。

2 結果

2.1 系統(tǒng)適應性 在對照品溶液和供試品溶液色譜圖相應位置上，有相同保留時間的色譜峰，見圖1。圖1表明建立的色譜條件能將哈巴苷、哈巴俄苷很好地分離。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.脈絡寧注射液；1.哈巴俄苷；2.哈巴苷Fig.1 HPLC chromatogramsA.Reference substance;B.Mailuoning injection; 1.Harpagoside;2.Harpagide

2.2 線性關系考察 以對照品進樣量(X)為橫坐標，色譜峰峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸，哈巴苷回歸方程分別為：Y=2854.7X-12.133，r=0.9998。哈巴俄苷回歸方程為Y=1815.4X+324.73，r=0.9997。結果表明哈巴苷進樣量0.1424～0.8544 μg范圍內(nèi)線性關系良好，哈巴俄苷進樣量在0.0732～0.4392 μg范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3 精密度考察 哈巴苷、哈巴俄苷色譜峰峰面積RSD分別為0.72%，1.29%(n=6)。結果表明儀器精密度良好。

2.4 重復性考察 哈巴苷的平均含量為3.175 g/L(RSD=2.31%)；哈巴俄苷的平均含量為0.4182 g/L(RSD=1.97%)。結果表明建立的方法重復性良好。

2.5 穩(wěn)定性考察 計算RSD分別為2.01%，1.82%。結果表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 回收率試驗 哈巴苷和哈巴俄苷的加樣。平均回收率分別為98.22%，99.27%。見表2、表3。

表2 脈絡寧注射液中哈巴苷回收率實驗結果(n=6)Tab.2 The recovery experiment results of harpagide in Mailuoning injection(n=6)

表3 脈絡寧注射液中哈巴俄苷回收率實驗結果(n=6)Tab.3 The recovery experiment results of harpagoside in Mailuoning injection(n=6)

2.7 樣品含量測定 樣品含量測定結果見表4。

表4 3批脈絡寧注射液中哈巴苷、哈巴俄苷含量測定結果(n=3)Fig.4 Determination results of harpagide and harpagoside in 3 batches of Mailuoning injection(n=3)

3 討論

本實驗曾采用乙腈-0.03%磷酸水溶液等度洗脫，但注射液中成分復雜，所得色譜峰峰形差，特征峰難以區(qū)分，經(jīng)不斷摸索最終選定文中梯度洗脫條件，并進行了相應方法學考察。脈絡寧注射液是由金銀花、玄參、牛膝等中藥精制提取而成的一種復方制劑[6]。金銀花性寒、味甘、氣芳香，具有清熱解毒，涼散風熱之功效。玄參味甘、苦、咸；性微寒；歸肺，胃，腎經(jīng)；玄參，稟至陰之性，專主熱病，味苦則泄降下行，故能治臟腑熱結等證。牛膝性味苦甘酸平，具有活血通經(jīng)，補肝腎，強筋骨，利尿通淋，引血(火)下行之功效。石斛，性味甘；微寒。歸胃、肺、腎經(jīng)。治療熱病傷津；口干煩渴；胃陰不足；胃痛干嘔；肺燥干咳；虛熱不退；陰傷目暗；腰膝軟弱。整個方劑合用具有養(yǎng)陰清熱、補益肝腎、活血化瘀的功效，臨床應用廣泛[7]。目前其質(zhì)量控制方法的研究多集中在酚酸類成分含量測定[8-10]，其他功效成分的測定卻鮮見報道。環(huán)烯醚萜苷類是玄參中的主要藥效成分，其含量對脈絡寧注射液的質(zhì)量具有重要影響。本文建立了HPLC法同時測定脈絡寧注射液中哈巴苷和哈巴俄苷含量測定方法，所建立的方法操作簡便、準確可靠，為脈絡寧注射液的多指標質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

[1] 于鋒，金亦濤，綦春玉，等.脈絡寧注射液藥理學研究進展[J].中國新藥雜志，2002，11(12)：920-924.

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[3] 孫國祥，史香芬.玄參的毛細管電泳指紋圖譜研究[J].中南藥學，2009，7(7)：540-544.

[4] 謝小艷，夏春森.中藥玄參的化學成分及藥理研究進展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2010，6(5)：121-125.

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[7] 完顏長旭，張黎明.脈絡寧注射液治療竇性心動過速160例[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2013，6(16)：6-7.

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(編校：王冬梅)

Simultaneous determination of harpagide and harpagoside in Mailuoning injection by HPLC

ZHOU Chang-kai1, GAO Jing2, SHI Shi-qiang1, HAO Li-ping1, JING Fan-bo1Δ

(1.Department of Pharmacy, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266100, China; 2.Department of Pharmacy, The Third People’s Hospital of Qingdao, Qingdao 266041, China)

ObjectiveTo establish a method for content determination of harpagide and harpagoside in Mailuoning injection by HPLC.MethodsThe experimental condition of HPLC method was as follows: SunfireTMC18column (4.6 mm×150 mm, 5 μm), with gradient elution using acetonitrile and 0.03% phosphoric acid; the detected wavelength was 210 nm, and the flow rate was 1.0mL/min.ResultsHarpagide and harpagoside demonstrated good linear relationship in the range 0.1424～0.8544 μg/mL(r=0.9998) and 0.0732～0.4392 μg/mL (r=0.9997) respectively.The average recovery rate were 98.22% and 99.27% with RSD of 1.46% and 1.42%(n=6)respectively.ConclusionThe method is simple, reliable, accurate, reproducible and stable, and it could be used in the determination of harpagide and harpagoside in Mailuoning injection.

Mailuoning injection; harpagide; harpagoside; content determination; HPLC

周長凱，男，碩士，藥師，研究方向：藥物新劑型與新技術、臨床藥學，E-mail：165643396@qq.com；荊凡波，通訊作者，男，碩士，副主任藥師，研究方向：臨床藥學、藥代動力學，E-mail：jingbf178@sina.com。

R286.0

A

1005-1678(2015)08-0173-03