HPLC測定急性淋巴細(xì)胞白血病患兒甲氨蝶呤血清濃度及應(yīng)用實踐研究

曲曉宇，張四喜，趙健琦，宋燕青

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 藥學(xué)部，吉林 長春 130021)

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HPLC測定急性淋巴細(xì)胞白血病患兒甲氨蝶呤血清濃度及應(yīng)用實踐研究

曲曉宇，張四喜，趙健琦，宋燕青Δ

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 藥學(xué)部，吉林 長春 130021)

目的 采用HPLC法檢測急性淋巴細(xì)胞白血病患兒血清中甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)的濃度并對其應(yīng)用進(jìn)行研究。方法 采用Wondasil C18-WR色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.15%磷酸(21︰79)，流速為1 mL/min，檢測波長306 nm，血清樣品經(jīng)高氯酸去蛋白后取20 μL進(jìn)樣分析并對患兒監(jiān)測結(jié)果建立監(jiān)測檔案。結(jié)果 甲氨蝶呤血清樣品在0.02～50 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9990，n=6)，方法平均回收率為96.50%，日間與日內(nèi)精密度RSD均小于15%。對6例患兒監(jiān)測結(jié)果建立檔案，3個療程后4例患兒甲氨蝶呤血藥濃度波動小且均處于安全范圍內(nèi)，可減少監(jiān)測頻次。結(jié)論 本方法準(zhǔn)確性好、操作簡單，完全滿足甲氨蝶呤血藥濃度監(jiān)測的需要。對各療程間血藥濃度穩(wěn)定且處于安全范圍的患兒建立檔案，可減少其檢測次數(shù)，減少患兒抽血的痛苦、減輕家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

甲氨蝶呤；高效液相色譜法；血藥濃度；監(jiān)測；應(yīng)用實踐

大劑量甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)沖擊治療結(jié)合亞葉酸鈣(calcium folinate,CF)解救是治療兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(actu lymphoblastic leukemia,ALL)的主要手段之一，該療法能夠大大減少ALL的發(fā)生，對兒童ALL的治療起到了關(guān)鍵作用[1]。在該方案實施過程中，如采用傳統(tǒng)方法即按體表面積計算MTX用量給藥時，不同患兒間MTX的穩(wěn)態(tài)血藥濃度(Css)個體差異很大。文獻(xiàn)報道，一定的Css和療效相關(guān)，而過量的CF會影響MTX的藥物療效，而當(dāng)MTX達(dá)到中毒劑量時，未及時給予CF解救又會產(chǎn)生毒性反應(yīng)，因此，臨床上往往需要通過監(jiān)測MTX血藥濃度，以調(diào)整CF的用量與次數(shù)，以避免中毒反應(yīng)的發(fā)生、提高療效[2-4]。本研究采取高效液相色譜法測定患兒血清中的MTX濃度，并對部分患兒建立MTX血藥濃度監(jiān)測檔案，為本院開展ALL患兒MTX血藥濃度監(jiān)測工作提供實踐經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 甲氨蝶呤對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：10138-201104)；甲醇(美國TEDIA公司，色譜純)；高氯酸為分析純，蒸餾水為本實驗室自制；健康人空白血清由本院輸血科提供，患兒血清由本院小兒腫瘤科提供。

1.2 儀器 Shimadzu 16-A液相色譜儀、SPD-16紫外檢測器(日本島津公司)；80-2B臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；高速離心機(jī)(美國ABBOTT公司)；FA2004分析天平(上海舜宇恒平公司)。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件：島津Wondasil C18-WR色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，Wondasil C18-WR保護(hù)住(4.0 mm×10 mm，5 μm)，流動相甲醇—0.15%磷酸溶液(21︰79)，流速1 mL/min，紫外檢測波長306 nm。

1.3.2 樣品處理：取5 mL未加入抗凝劑靜脈血(紅色蓋頭抽血管)，4000 r/min離心5 min，取上層淡黃色液體即為血清樣品。取200 μL血清樣品，滴加甲氨蝶呤對照品溶液20 μL，再加入20%高氯酸溶液30 μL，渦旋混合30 s，于10900 r/min條件下離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，取20 μL進(jìn)樣分析。

1.3.3 系列標(biāo)準(zhǔn)血清樣品與質(zhì)控血清樣品的制備：取甲氨蝶呤對照品精密稱定后，用10%磷酸溶液配制成100 μg/mL的甲氨蝶呤對照品貯備液。用空白血漿和甲氨蝶呤貯備液分別配制濃度為0.02、0.05、0.1、0.25、0.5、1.00、2.00、5.00、10.00、25.00、50.00 μg/mL的甲氨蝶呤系列標(biāo)準(zhǔn)血清樣品。同法配制濃度為甲氨蝶呤濃度為0.02、0.05、1.28及32.00 μg/mL的質(zhì)控血清樣品。各血清樣品分別裝于2 mL塑料離心管中，置-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：采取分段法繪制甲氨蝶呤系列標(biāo)準(zhǔn)血清樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線由0.02、0.05、0.1、0.25、0.5、1.00 μg/mL 6個濃度繪制，高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線由1.00、2.00、5.00、10.00、25.00、50.00 μg/mL 6個濃度繪制。經(jīng)微孔濾膜過濾后，取20 μL進(jìn)樣分析。

1.3.5 專屬性：分別取甲氨蝶呤對照品、空白血清和血清樣品及患者用藥后血清樣品按照樣品處理方法處理后進(jìn)樣，考察色譜行為的專屬性。

1.3.6 加樣回收率與精密度測試：采用外標(biāo)法檢測，另外配制甲氨蝶呤質(zhì)控對照溶液，分別測定線性末端濃度0.02 μg/mL，線性末端3倍濃度0.05 μg/mL，中間濃度1.28 μg/mL及高濃度75%范圍的32.00 μg/mL 4個濃度水平的甲氨蝶呤質(zhì)控血漿樣品以檢測加樣回收率。另外，取質(zhì)控血漿樣品進(jìn)樣，檢測日間精密度(5個工作日每份樣品每天測定1次)及日內(nèi)精密度(每份樣品平行測定6次)。

1.3.7 方法應(yīng)用考察：對本院2015年1月1日～2015年5月30日期間小兒腫瘤科應(yīng)用甲氨蝶呤大劑量沖擊療法治療ALL的部分患者進(jìn)行甲氨蝶呤血藥濃度監(jiān)測，共涉及患兒6例，其中男4例，女2例，年齡3～13歲，均為需多療程化療的ALL患兒。ALL患兒血藥濃度監(jiān)測點為用藥后24、48和72 h，甲氨蝶呤在3個時間點的中毒濃度分別為>10、1和0.1 μmol/L[5]，每位患兒監(jiān)測3個療程。

2 結(jié)果

2.1 專屬性 結(jié)果顯示，甲氨蝶呤對照品在14.4 min處出峰，空白血清在甲氨蝶呤對照品出峰處無雜峰干擾，背景干凈。見圖1。

圖1 各樣品溶液的高效液相色譜圖A.空白血漿；B.甲氨蝶呤對照溶液；C.甲氨蝶呤血清樣品；D.患者血清Fig.1 HPLC of each sample solutionA.Blank serum; B.Methotrexate control solution; C.Serum sample contained with methotrexate; D.ALL children serum

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 結(jié)果顯示，以峰面積(X)對濃度(Y)進(jìn)行線性回歸，低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.02～1.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=2×10-5X-0.041(r=0.9990，n=6)；高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線在1.00～50 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=2×10-5X+0.018(r=0.9990，n=6)，MTX檢測線為0.02 μg/mL。

2.3 回收率與精密度 經(jīng)加樣回收率測定方法，得平均回收率為96.50%，日內(nèi)精密度與日間精密度均滿足RSD<15%。見表1。

表1 樣品加樣回收率測定與精密度測定結(jié)果Tab.1 Results of recoveries and RSD within day and between days

2.4 方法應(yīng)用結(jié)果 進(jìn)行監(jiān)測的ALL患兒MTX具體用藥方法及監(jiān)測結(jié)果，見表2。對6例患兒的監(jiān)測結(jié)果顯示有4例患兒各療程間MTX血藥濃度波動很小且均在安全劑量范圍。3號患兒與4號患兒在相同給藥劑量下各療程MTX血藥濃度波動較大，其中4號患兒治療過程中MTX達(dá)到了中毒濃度，對其進(jìn)行增加一次CF解救處置，在用藥后96 h時間點增加一次MTX血藥濃度監(jiān)測，對其96 h時間點的MTX血藥濃度監(jiān)測結(jié)果顯示均為未檢出。3號患兒雖未達(dá)到中毒濃度，但療程間MTX血藥濃度波動較大，因此建議其繼續(xù)監(jiān)測，暫不減少監(jiān)測次數(shù)。

表2 ALL患兒基本情況及甲氨蝶呤血藥濃度監(jiān)測結(jié)果Tab.2 Information of ALL children and monitoring data of MTX blood concentration

3 討論

由于甲氨蝶呤血藥濃度個體差異較大，對開始進(jìn)行甲氨蝶呤大劑量沖擊療法治療的ALL患兒進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測，能夠有效的提示因甲氨蝶呤濃度高于中毒濃度而引起的不良反應(yīng)，幫助臨床醫(yī)生做出判斷以采取有效措施，同時，CF解救劑量過大又會引起甲氨蝶呤濃度下降而影響療效。有研究表明，目前常用的快速檢測方法如酶聯(lián)免疫技術(shù)等存在抗體交叉反應(yīng)，造成MTX測定結(jié)果偏高[6]。本研究建立高效液相色譜法監(jiān)測甲氨蝶呤血藥濃度的方法，該方法穩(wěn)定、可靠，且操作簡單，成本低廉。由于MTX不溶于甲醇與乙腈，因此前處理采用高氯酸進(jìn)行沉淀蛋白，基線平穩(wěn)不影響測定[7-8]。本研究對患兒監(jiān)測結(jié)果進(jìn)行建檔并建議多療程監(jiān)測結(jié)果穩(wěn)定且均在安全濃度范圍內(nèi)的患兒適當(dāng)減少監(jiān)測頻次，以減少患兒痛苦、減輕家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，取得了良好的效果。同時本研究發(fā)現(xiàn)，給藥后48 h血藥濃度與72 h具有一定的相關(guān)性，因此在48 h測定值在安全濃度范圍內(nèi)的患兒可不再監(jiān)測72 h血藥濃度[9-10]。本研究為臨床應(yīng)用提供了參考依據(jù)。

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(編校：王冬梅)

Determination of serum concentration of methotrexate in children with acute lymphoblastic leukemia by HPLC and application practice research

QU Xiao-yu, ZHANG Si-xi, ZHAO Jian-qi, SONG Yan-qingΔ

(Department of Pharmacy, The First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, China)

ObjectiveTo determine serum concentration of methotrexate in children with acute lymphoblastic leukemia by HPLC and explore the application practice.MethodsThe separation was performed in a Wondasil C18-WR column (4.6 mm×150 mm, 5 μm) with a mobile phase of methanol-0.15%phosphoric acid solution(21:79) and determined at 306 nm.The sample of serum was centrifuged after protein precipitation with perchloric acid.Detected results for children to establish monitoring files.ResultsThe linearity was well at 0.02～50 μg/mL of methotrexate(r=0.9990，n=6).The average recovery was 96.50%, RSD of within day and between days were less than 15%.Established monitoring files for six children and after 3 courses of treatment, the blood concentration of methotrexate in 4 children were small and they were in a safe range, which could reduce the frequency of monitoring.ConclusionThis method is simple, sensitive and accurate for methotrexate detection in serum.The children with stable concentration and within safety range, can reduce monitioring frequency.It could bring the children less pain and relieve the burden of family.

methotrexate; HPLC; blood concentration; monitoring; application practice

曲曉宇，男，碩士，主管藥師，研究方向：臨床藥學(xué)， E-mail：quxiaoyuhaha@163.com；宋燕青，通訊作者，女，博士，主管藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)， E-mail：350740439@qq.com。

R733.71

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1005-1678(2015)08-0176-03