甘肅野生草地早熟禾原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)研究

?？e，俞 玲，李玉珠，馬暉玲

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅蘭州 730070)

甘肅野生草地早熟禾原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)研究

?？e，俞 玲，李玉珠，馬暉玲

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅蘭州 730070)

建立高效的原生質(zhì)體再生體系是通過(guò)原生質(zhì)體融合技術(shù)培育草地早熟禾(Poapratensis)新品種的重要前提。以甘肅隴西野生草地早熟禾(LX)和定西野生草地早熟禾(DX)胚性愈傷組織為材料，探索其原生質(zhì)體游離和培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，LX和DX原生質(zhì)體分離的最佳酶液組合為1.5%纖維素酶R-10+0.5%果膠酶Y-23+1.0%離析酶R-10+0.3%崩潰酶；酶解時(shí)間為16 h；LX原生質(zhì)體最適宜的甘露醇濃度為0.6 mol·L-1，而DX原生質(zhì)體的最適甘露醇濃度為0.5 mol·L-1。LX原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高可達(dá)6.59×106個(gè)·g-1，DX可達(dá)5.95×106個(gè)·g-1。DX原生質(zhì)體培養(yǎng)的最適密度為3.0×105個(gè)·mL-1，最適2,4-D濃度為1.0 mg·L-1，此時(shí)，DX原生質(zhì)體再生細(xì)胞的分裂頻率可達(dá)9.56%，植板率為4.62%。

野生草地早熟禾；原生質(zhì)體；分離；培養(yǎng)

草地早熟禾(Poapratensis)作為一種優(yōu)良的冷地型草坪草種，在溫帶地區(qū)使用非常廣泛。但由于其抗旱性差、易感病，且我國(guó)的草種幾乎全部靠進(jìn)口，引進(jìn)品種難以很好的適應(yīng)我國(guó)當(dāng)?shù)丨h(huán)境，使得草地早熟禾的應(yīng)用受到嚴(yán)重限制。我國(guó)分布有大量草地早熟禾的野生種和近緣種，且具有許多優(yōu)良性狀[1-2]，是良好的育種材料。利用育種技術(shù)來(lái)培育具有優(yōu)良性狀的草地早熟禾新品種是解決以上問(wèn)題的途徑之一。由于草地早熟禾是兼性無(wú)融合生殖植物，有些品種的無(wú)融合生殖率高達(dá)98%[3]，故利用常規(guī)雜交在品種選育和性狀改良方面存在一定的困難和局限性。植物原生質(zhì)體融合技術(shù)可以針對(duì)性地將早熟禾野生種中的優(yōu)良性狀向栽培種中轉(zhuǎn)移，特別是對(duì)于轉(zhuǎn)移那些多基因控制的性狀而言，原生質(zhì)體融合技術(shù)將是一條捷徑。

植物原生質(zhì)體融合技術(shù)是以原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)為基礎(chǔ)的。目前，國(guó)內(nèi)外已建立起一些草地早熟禾栽培品種的原生質(zhì)體再生體系。1988年，Van der Valk等[4]建立了‘Kimono’與‘Merion’這兩個(gè)草地早熟禾品種的懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體再生體系； 隨后，Nielsen等[5]對(duì)草地早熟禾‘Geronimo’進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)，得到了127株再生植株；馬暉玲等[6]和趙小強(qiáng)等[7]分別建立了草地早熟禾‘MidnightⅡ’和‘Nuglade’愈傷組織的原生質(zhì)體培養(yǎng)體系，并獲得了再生植株。然而，不同品種的原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)條件差別較大[5-6]。Van der Valk等[4]和Nielsen[5]等選用懸浮細(xì)胞系作為原生質(zhì)體的分離材料，而由懸浮細(xì)胞分離得到的原生質(zhì)體，存在其再生植株發(fā)生染色體數(shù)目和倍性變化的概率較大的問(wèn)題。另外，在前期的研究中曾嘗試將馬暉玲等[6]和趙小強(qiáng)等[7]建立的草地早熟禾商用品種原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)體系應(yīng)用于本研究，但所得原生質(zhì)體的產(chǎn)量很少，不能滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。因此，本研究以具有較強(qiáng)抗旱性的隴西和定西野生草地早熟禾[8]的胚性愈傷組織為材料，對(duì)其原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)條件進(jìn)行一定的探索，以期為進(jìn)一步開(kāi)展草地早熟禾商用品種與野生種的原生質(zhì)體融合奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料及胚性愈傷組織的獲得

以隴西野生草地早熟禾(LX)和定西野生草地早熟禾(DX)的種子為材料，誘導(dǎo)胚性愈傷組織。愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)條件及方法同俞玲和馬暉玲[9]的報(bào)道，愈傷組織每25 d左右繼代一次，每次繼代時(shí)挑選胚性愈傷組織(淡黃色、顆粒狀、質(zhì)地堅(jiān)硬)，連續(xù)繼代7～8次后，愈傷組織生長(zhǎng)能力明顯提高，此時(shí)，顯微鏡下可觀察到細(xì)胞多為小橢圓形細(xì)胞，其大小均一、細(xì)胞質(zhì)濃、分裂旺盛，并且細(xì)胞排列緊密，這種愈傷組織即為胚性愈傷組織。

1.2 原生質(zhì)體分離和純化

取繼代培養(yǎng)8～10次，且在新鮮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10 d左右的胚性愈傷組織約1.0 g，放入10 mL酶液中。酶溶劑同馬暉玲等[6]和趙小強(qiáng)等[7]的報(bào)道，為CPW溶液，pH為5.8，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾滅菌。酶解混合物靜置30 min后，置于25 ℃、黑暗條件、50 r·min-1的恒溫?fù)u床上震蕩酶解16 h。經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的酶解，將酶液混合物經(jīng)無(wú)菌尼龍網(wǎng)篩(76、40 μm)過(guò)濾，濾液經(jīng)常溫低速離心機(jī)離心8 min(500 r·min-1)，收集原生質(zhì)體，去掉上清液，用清洗液(CPW溶液+0.6 mol·L-1甘露醇)重新懸浮，再離心，這樣反復(fù)兩次，最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌一次。

本試驗(yàn)共設(shè)定7個(gè)酶處理組合(表1)，其他酶解條件參照趙小強(qiáng)等[7]的報(bào)道。酶解時(shí)間為16 h，甘露醇的濃度為0.7 mol·L-1甘露醇。

在上述研究的基礎(chǔ)上，在Ⅳ號(hào)酶組合處理下分別對(duì)甘露醇濃度(酶解16 h)和酶解時(shí)間(0.7 mol·L-1甘露醇)進(jìn)行研究。甘露醇濃度為0.4、0.5、0.6、0.7 mol·L-1共4個(gè)梯度，酶解時(shí)間為8、10、12、14、16、18、20 h共7個(gè)處理。所有處理均重復(fù)3次。

1.3 原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的測(cè)定

原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的測(cè)定及計(jì)算方法同李玉珠等[10]的報(bào)道。

1.4 原生質(zhì)體培養(yǎng)

將分離和純化后的2 mL DX原生質(zhì)體懸浮液以不同的密度(1×105、2×105、3×105和5×105個(gè)·mL-1)培養(yǎng)于60 mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行靜置淺層培養(yǎng)。液體培養(yǎng)基為添加了1.0%蔗糖、100 mg·L-1水解酪蛋白、200 mg·L-1水解乳蛋白、0.4 mol·L-1甘露醇、1.0 mg·L-12,4-D和0.1 mg·L-16-BA的KM8P培養(yǎng)基，pH為5.8，培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃，暗培養(yǎng)，每隔一周，添加0.4 mL左右甘露醇濃度依次減半的新鮮培養(yǎng)基，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體再生細(xì)胞的分裂頻率(15 d后)和植板率(30 d后)。另外，以3×105個(gè)·mL-1的密度將原生質(zhì)體培養(yǎng)于含有不同2,4-D濃度(0.5、1.0、2.0和3.0 mg·L-1)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞分裂頻率和植板率。

表1 不同的酶處理組合

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 13.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生草地早熟禾愈傷組織原生質(zhì)體的分離

2.1.1 甘露醇濃度對(duì)原生質(zhì)體分離的影響 0.5和0.6 mol·L-1的甘露醇有利于DX和LX原生質(zhì)體的游離，但對(duì)兩種草地早熟禾原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力的影響不同(圖1)。DX原生質(zhì)體游離的最適甘露醇濃度為0.5 mol·L-1，此時(shí)其產(chǎn)量和活力均達(dá)到最高，分別為3.60×106個(gè)·g-1和65.12%，但與0.6 mol·L-1的甘露醇處理下相比差異不顯著(P>0.05)；對(duì)LX而言，當(dāng)甘露醇濃度為0.6 mol·L-1時(shí)，其原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力均達(dá)到最高，分別為3.84×106個(gè)·g-1和68.43%。因此，0.6和0.5 mol·L-1可分別作為L(zhǎng)X和DX原生質(zhì)體分離所需的最適甘露醇濃度。

2.1.2 不同的酶處理組合對(duì)原生質(zhì)體分離的影響 在不同酶液處理下，原生質(zhì)體的分離結(jié)果相差很大(圖2)。酶組合Ⅱ下，LX和DX原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力均高于Ⅰ和Ⅲ，表明1.5%的纖維素酶更有利于原生質(zhì)體的游離；組合Ⅳ和Ⅵ的LX和DX原生質(zhì)體的產(chǎn)量和LX的原生質(zhì)體活力均分別顯著高于Ⅱ和Ⅲ(P<0.05)，表明1.0%的離析酶會(huì)提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量與活力；同樣，處理Ⅴ和Ⅶ下DX和LX原生質(zhì)體的產(chǎn)量顯著高于Ⅳ和Ⅵ(P<0.05)，表明0.3%的崩潰酶可提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量；在組合Ⅴ下，LX原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力最高，分別為5.35×106個(gè)·g-1和82.70%，在組合Ⅶ下，DX原生質(zhì)體的產(chǎn)量高于組合Ⅴ，但是活力卻明顯低于組合Ⅴ。綜上所述，組合Ⅴ即1.5%纖維素酶+0.5%果膠酶+1.0%離析酶+0.3%崩潰酶最有利于LX和DX原生質(zhì)體的游離。

圖1 甘露醇濃度對(duì)LX和DX原生質(zhì)體產(chǎn)量及活力的影響Fig.1 Effect of mannitol concentration on protoplast yield and viability of LX and DX

注：不同字母表示同一種不同處理間差異顯著(P<0.05)；LX表示隴西野生草地早熟禾，DX表示定西野生草地早熟。下同。

Note: Different lower case letters for the same variety indicate significant difference among different treatments at 0.05 level. LX represents Longxi wild kentucky bluegrass. DX represents Dingxi wild kentucky bluegrass. The same below.

圖2 不同的酶處理組合對(duì)LX和DX原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響Fig.2 Effect of enzyme compositions on protoplast yield and viability of LX and DX

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體分離的影響 在8～18 h內(nèi)，LX和DX原生質(zhì)體的產(chǎn)量隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增高(圖3)，其活力先緩慢增加(8～16 h)，后降低(18 h)。8 h不利于甘肅野生草地早熟禾原生質(zhì)體的分離，此時(shí)LX和DX原生質(zhì)體產(chǎn)量均為最低，并且原生質(zhì)體的細(xì)胞壁有殘留，原生質(zhì)體多粘成一團(tuán)，不利于觀察統(tǒng)計(jì)；當(dāng)酶解時(shí)間為16 h時(shí)，LX原生質(zhì)體的產(chǎn)量顯著地提高(P<0.05)，當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)到18 h時(shí)，其產(chǎn)量雖有所增加，但活力則開(kāi)始明顯地降低，并且有大量的碎片產(chǎn)生；當(dāng)酶解時(shí)間在14～18 h內(nèi)，DX原生質(zhì)體的產(chǎn)量雖逐漸增高，但差異并不顯著(P>0.05)，其活力同樣在18 h時(shí)有明顯的下降。上述結(jié)果表明，16 h是LX和DX原生質(zhì)體的最佳酶解時(shí)間，此時(shí)LX和DX原生質(zhì)體產(chǎn)量分別為6.92×106和6.03×106個(gè)·g-1，活力分別為89.6%和85.3%。

2.2 DX原生質(zhì)體培養(yǎng)

2.2.1 培養(yǎng)密度對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響 不同原生質(zhì)體培養(yǎng)密度對(duì)其再生細(xì)胞分裂頻率和植板率的影響各異(表2)，較高的培養(yǎng)密度有利于提高再生細(xì)胞分裂頻率和植板率，當(dāng)培養(yǎng)密度較低時(shí)(1.0×105、2.0×105個(gè)·mL-1)時(shí)，再生細(xì)胞的分裂頻率和植板率均較低，尤其是植板率(僅為0.17%和0.55%)；當(dāng)培養(yǎng)密度為3×105個(gè)·mL-1時(shí)，細(xì)胞分裂頻率和植板率顯著地高于其他處理(P<0.05)，其植板率約為1×105個(gè)·mL-1的24倍；但當(dāng)培養(yǎng)密度繼續(xù)增加到5×105個(gè)·mL-1，再生細(xì)胞分裂頻率和植板率都開(kāi)始降低。故DX原生質(zhì)體的最佳培養(yǎng)密度為3×105個(gè)·mL-1。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)LX和DX原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響Fig.3 Effect of enzyme digestion time on protoplast yield and viability of LX and DX 表2 培養(yǎng)密度對(duì)DX原生質(zhì)體再生細(xì)胞 分裂頻率及植板率的影響 Table 2 Effects of protoplast density on the cell division frequencies and planting efficiencies of DX protoplasts

原生質(zhì)體密度Protoplastdensity/×105number·mL-1細(xì)胞分裂頻率Celldivisionfrequencies/%植板率Platingefficiencies/%1．02．08±0．44c0．17±0．04c2．03．91±0．35bc0．55±0．09c3．08．87±0．69a4．02±0．87a5．05．10±0．48b1．79±0．31b

注：同列不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lower case letters within the same column indicate significant difference among different treatments at 0.05 level. The same below.

2.2.2 2,4-D對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響 2,4-D對(duì)DX原生質(zhì)體再生細(xì)胞的分裂頻率及植板率也有一定的影響(表3)，當(dāng)2,4-D的濃度從0.5 mg·L-1增至1.0 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞分裂頻率由3.89%提高到9.56%，而當(dāng)2,4-D過(guò)高(≥2.0 mg·L-1)時(shí)，反而會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，導(dǎo)致分裂頻率和植板率均顯著地降低(P<0.05)。由此可見(jiàn)，過(guò)高或過(guò)低的2,4-D濃度均不利于原生質(zhì)體再生細(xì)胞的分裂，DX原生質(zhì)體培養(yǎng)最適的2,4-D濃度為1.0 mg·L-1。

表3 2,4-D對(duì)DX原生質(zhì)體再生細(xì)胞分裂頻率及植板率的影響

2.2.3 原生質(zhì)體培養(yǎng)形成小愈傷組織 DX胚性愈傷組織(圖4-A)經(jīng)酶解后可產(chǎn)生大量活力較高的原生質(zhì)體(圖4-B、圖4-C)，將這些原生質(zhì)體以3×105個(gè)·mL-1的密度培養(yǎng)于添加1.0 mg·L-12,4-D的培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～4 d后，可觀察到原生質(zhì)體再生細(xì)胞的第1次分裂(圖4-D)，隨后繼續(xù)觀察可以看到第2、3次分裂和形成小細(xì)胞團(tuán)(圖4-E、圖4-F、圖4-G)，4周后，可產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的小愈傷組織(圖4-H)。

3 討論

3.1 供試材料的選擇

對(duì)于禾本科植物而言，用于原生質(zhì)體分離的材料通常是懸浮細(xì)胞系和胚性愈傷組織。由于愈傷組織取材方便，且使用不受時(shí)間和季節(jié)的限制[11]，陳東方和夏鎮(zhèn)澳[12]用棒頭草(Polypogonfugax)胚性愈傷組織作為材料，游離出了大量活力較高的原生質(zhì)體，其研究結(jié)果表明，以胚性愈傷組織作為材料更具有優(yōu)越性。這主要是由于獲得胚性愈傷組織比建立細(xì)胞懸浮系所需的時(shí)間要短得多，有利于植株再生能力的保持，且培養(yǎng)后容易誘導(dǎo)植株再生。馬暉玲等[6]也利用草地早熟禾‘午夜Ⅱ號(hào)’的胚性愈傷組織作為原生質(zhì)體游離材料，獲得了大量原生質(zhì)體，并再生出完整植株。本試驗(yàn)以胚性愈傷組織為分離LX和DX原生質(zhì)體的材料，得到了大量的、活力較高的原生質(zhì)體。

3.2 酶液組合、酶解時(shí)間和甘露醇對(duì)LX和DX原生質(zhì)體分離的影響

影響原生質(zhì)體分離的主要因素有：酶的種類及濃度、酶解時(shí)間和甘露醇的濃度。植物材料不同，其酶解條件不同，即使是同一種植物，外植體的選擇不同，酶解條件也會(huì)不同[5-7,10-12]。本研究探索了7個(gè)酶液組合對(duì)LX和DX原生質(zhì)體分離的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，最適宜的酶液組合為1.5%纖維素酶+0.5%果膠酶+1.0%離析酶+0.3%崩潰酶，1.0%的離析酶和0.3%的崩潰酶的添加，可顯著地提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量，這與趙小強(qiáng)等[7]的研究結(jié)果相似，但李玉珠等[10]研究表明，0.3%離析酶可降低百脈根(Lotuscorniculatus)子葉和愈傷組織原生質(zhì)體產(chǎn)量。另外，本試驗(yàn)表明當(dāng)纖維素酶的濃度由1.5%增高到2.0%時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，這說(shuō)明酶的濃度要適宜，過(guò)高或過(guò)低均不利于原生質(zhì)體的分離，張小紅等[13]研究同樣表明，低濃度酶液組合下小麥(Triticumaestivum)愈傷組織原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力要高于高濃度酶液組合的。

圖4 DX原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)過(guò)程Fig.4 Progress of DX protoplast isolation and culture

注：A，胚性愈傷組織；B，分離的原生質(zhì)體；C，有活力的原生質(zhì)體；D，原生質(zhì)體第1次分裂；E，原生質(zhì)體第2次分裂；F，原生質(zhì)體第3次分裂；G，小細(xì)胞團(tuán)；H，小愈傷組織。

Note: A，embryogenic calli; B，freshly isolated protoplasts from calli; C，viable protoplasts; D，first division of protoplast-derived cell; E，second division of protoplast-derived cell; F，third division of protoplast-derived cell; G，cell cluster formed from protoplast-derived cell; H，Microcalli formed from protoplast-derived cell.

酶解時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)非常明顯地影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量與活力，過(guò)短會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體的產(chǎn)量大幅度地降低，而過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體的活力下降，且會(huì)導(dǎo)致分離出的原生質(zhì)體破碎，進(jìn)而使得產(chǎn)量也隨之降低[14]。本研究中，當(dāng)酶解時(shí)間由8 h延長(zhǎng)到18 h時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸增加；當(dāng)酶解時(shí)間為18 h時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量均達(dá)到最高，但是與16 h時(shí)相比，原生質(zhì)體的活力均顯著下降。

適宜的滲透壓是獲得高活力原生質(zhì)體的必要條件，植物材料不同適宜的滲透壓不同，一般植物的滲透壓都在0.4～0.7 mol·L-1[15-16]，本研究結(jié)果表明，DX和LX愈傷組織原生質(zhì)體分離最適宜的甘露醇濃度不同，分別為0.5和0.6 mol·L-1。

3.3 培養(yǎng)密度和2,4-D對(duì)DX原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響

原生質(zhì)體的起始培養(yǎng)密度對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)影響很大，過(guò)高或過(guò)低的培養(yǎng)密度均不易獲得較高的分裂頻率和植板率[11]。Inokuma等[17]研究表明，日本結(jié)縷草(Zoysiajaponica)原生質(zhì)體的最適培養(yǎng)密度為10×105個(gè)·mL-1；陳文品等[18]研究表明，只有當(dāng)多年生黑麥草(Loliumperenne)原生質(zhì)體密度達(dá)到一定值(≥1.0×105個(gè)·mL-1)時(shí)，才能產(chǎn)生細(xì)胞團(tuán)，最適的培養(yǎng)密度為8.0×105個(gè)·mL-1。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)DX原生質(zhì)體的培養(yǎng)密度較高時(shí)(3.0×105個(gè)·mL-1)，其分裂頻率最高，可達(dá)8.87%。大量的研究表明，物種不同，原生質(zhì)體的最適培養(yǎng)密度也不相同[17-19]。

2,4-D 是原生質(zhì)體再生細(xì)胞分裂、愈傷組織和誘導(dǎo)體細(xì)胞胚形成不可缺少的一種生長(zhǎng)激素之一。本研究結(jié)果表明，較低濃度的2,4-D(1.0 mg·L-1)最有利于DX原生質(zhì)體再生細(xì)胞分裂。許多研究者[12,17-21]在原生質(zhì)體起始培養(yǎng)時(shí)，都采用較低濃度(0.5～2.0 mg·L-1)的2,4-D。

4 結(jié)論

LX原生質(zhì)體分離的最佳條件為：1.5%纖維素酶R-10+0.5%果膠酶Y-23+1.0%離析酶R-10+0.3%崩潰酶，16 h，0.6 mol·L-1甘露醇；DX原生質(zhì)體分離的最佳條件為：1.5%纖維素酶R-10+0.5%果膠酶Y-23+1.0%離析酶R-10+0.3%崩潰酶，16 h，0.5 mol·L-1甘露醇；DX原生質(zhì)體培養(yǎng)的最適密度為3.0×105個(gè)·mL-1，最適2,4-D濃度為1.0 mg·L-1。

致謝：該論文是第二屆全國(guó)草業(yè)生物技術(shù)大會(huì)評(píng)選出的優(yōu)秀論文，并得到中國(guó)草業(yè)生物技術(shù)專業(yè)委員會(huì)提供的版面費(fèi)支持。

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(責(zé)任編輯 王芳)

2015年第6期《草業(yè)科學(xué)》審稿專家

安 淵 包愛(ài)科 柴 琦 常文環(huán) 陳先江 鄧 馨 干友民 郭良棟 韓云華

侯扶江 胡小文 李惠霞 李建龍 李彥忠 梁天剛 林恭華 林慧龍 劉金榮

劉文獻(xiàn) 劉文獻(xiàn) 劉興元 馬偉強(qiáng) 毛祝新 毛祝新 穆春生 彭 燕 蒲小鵬

任安芝 孫 會(huì) 孫玉誠(chéng) 田 沛 萬(wàn)怡震 王桔紅 王曉娟 王兆龍 翁秀秀

伍國(guó)強(qiáng) 席杰軍 徐云遠(yuǎn) 楊培志 楊允菲 于應(yīng)文 袁明龍 張 博 張衛(wèi)國(guó)

趙 軍 趙萌莉

承蒙以上專家對(duì)《草業(yè)科學(xué)》期刊稿件的審閱，特此表示衷心的感謝！

Protoplast isolation and culture of wild Kentucky Bluegrass in Gansu

NIU Kui-ju, YU Ling, LI Yu-zhu, MA Hui-ling

(Pratacultural College, Gansu Agricultural University, Key laboratory of Grassland Ecosystem, Ministry of Education, Sino-U.S. Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability, Lanzhou 730070, China)

In the present study, the conditions of protoplast isolation and culture were explored using embryogenic callus from wild Kentucky Bluegrass variety Longxi (LX) and Dingxi (DX). The results showed that the optimal conditions for protoplast isolation was enzyme composition including 1.5% Cellulase R-10+0.5% Pectolase Y-23+1.0% Macerozyme R-10+0.3% Driselase with 16 h digestion. The optimal mannitol concentration was 0.6 mol·L-1for LX protoplast and 0.5 mol·L-1for DX protoplast. The highest yield of protoplasts was 6.59×106number·g-1for LX and 5.95×106number·g-1for DX. After purification, DX protoplasts were cultured in KM8P liquid medium. With 3.0×105number·mL-1plating density and 1.0 mg·L-12,4-D, DX protoplasts had highest cell division frequency of 9.56% and plating efficiency of 4.62%.

wild Kentucky bluegrass; protoplast; isolation; culture

MA Hui-ling E-mail:mahl@gsau.edu.cn

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0575

2014-12-18 接受日期：2015-03-25

國(guó)家自然科學(xué)基金——草地早熟禾種間體細(xì)胞雜交的研究(31160482)

?？e(1991-)，男，甘肅通渭人，在讀碩士生，研究方向?yàn)椴莘N質(zhì)資源及育種。E-mail:niukuiju@163.com

馬暉玲(1966-)，女(回族)，甘肅蘭州人，教授，博士，研究方向?yàn)槟敛菁安萜翰萦N。E-mail:mahl@gsau.edu.cn

S543+.904.3;Q943.1

A

1001-0629(2015)06-0927-08

?？e，俞玲，李玉珠，馬暉玲.甘肅野生草地早熟禾原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)研究[J].草業(yè)科學(xué),2015,32(6):927-934.

NIU Kui-ju,YU Ling,LI Yu-zhu,MA Hui-ling.Protoplast isolation and culture of wild Kentucky Bluegrass in Gansu[J].Pratacultural Science,2015,32(6)：927-934.