高羊茅根際一種短體線蟲的分離與鑒定

陳 艷，高利媛，馬 騰，高文娜，賀 佳，劉興亮，郭 巍，邊 勇

(1.北京農(nóng)學院，北京 102206； 2.北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026)

動物生產(chǎn)層

高羊茅根際一種短體線蟲的分離與鑒定

陳 艷1，高利媛1，馬 騰2，高文娜2，賀 佳1，劉興亮2，郭 巍1，邊 勇2

(1.北京農(nóng)學院，北京 102206； 2.北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026)

高羊茅(Festucaelata)是草坪草中綠期最長的一個草種，在草坪建植中具有重要作用。一些病害隨著高羊茅種植范圍的不斷擴大而逐漸頻發(fā)，對草坪造成極大經(jīng)濟損失。本研究通過調(diào)查北京市高麗營鎮(zhèn)高羊茅斑塊狀枯死的原因發(fā)現(xiàn)，導致高羊茅枯死的是高羊茅根際優(yōu)勢植物寄生線蟲。采用貝爾曼漏斗法分離了侵染北京地區(qū)高羊茅上的線蟲，結(jié)合唇環(huán)、受精囊、食道、V值等形態(tài)學鑒定方法，證明高羊茅草根際優(yōu)勢植物的寄生線蟲均為一種短體線蟲，確定為斯克里步納短體線蟲(Pratylenchusscribneri)。線蟲ITS和28S序列的PCR擴增及GenBank序列比對后發(fā)現(xiàn)，其與國外發(fā)現(xiàn)的P.agilis及P.scribneri序列相似度為93%，亦確證該線蟲為斯克里步納短體線蟲。

高羊茅；斯克里步納短體線蟲；分離鑒定

目前草坪在城市的綠化事業(yè)進程中發(fā)揮著凈化空氣、優(yōu)化環(huán)境和提供優(yōu)質(zhì)運動場所等重要作用，因此，草坪漸漸成為現(xiàn)代生活中不可或缺的部分[1]。我國的草坪業(yè)亦呈現(xiàn)出迅速發(fā)展的趨勢，對草坪草的需求量越來越大。高羊茅(Festucaelata)作為常見的草坪草中綠色周期最長的一個冷季型草種，目前已成為我國首選草坪草植物。然而，隨著高羊茅草坪草種植規(guī)模的不斷擴大，各種病蟲害逐漸突出，導致高羊茅草坪外觀質(zhì)量下降，成為制約這一產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制因素之一[2]。

在我國，關于草坪草病害的報道主要集中在褐斑病、銹病等真菌病害，而關于植物寄生線蟲危害草坪草的研究相對較少。在美國等一些草業(yè)較為發(fā)達的國家，植物寄生線蟲一直都是十分重要的草坪草病害之一，美國草坪草的常見致病線蟲主要有擬毛刺線蟲屬(Paratrichodorus)、劍線蟲屬(Xiphinema)、長針線蟲屬(Longidorus)、胞囊線蟲屬(Heterodera)、根結(jié)線蟲屬(Meloidegyne)、假根結(jié)線蟲屬(Hypasoperine)、環(huán)紋線蟲屬(Macropasthonia)、針線蟲屬(Paratylenchus)、根腐線蟲屬(Proatylenchus)、刺線蟲屬(Belonolaimus)、錐線蟲屬(Dolichorus)、矮化線蟲屬(Tylenchorhynochus)、螺旋屬(Helicotylenchus)和槍線蟲屬(Hoploaimus)等[3]。目前，國內(nèi)已報道的危害草坪草根際的短體線蟲主要包括矮化線蟲屬、小環(huán)線蟲屬(Criconemella)、短體屬(Pratylenchus)、螺旋屬和毛刺屬(Trichodorus)內(nèi)的線蟲[4]等。國內(nèi)危害草坪草的線蟲研究工作仍不深入，但植物根際線蟲的危害不可小覷，其主要是在植物根部取食，給植物造成傷口從而引起細菌、真菌病害的傳播，引起植物的枯黃、腐爛等癥狀[5-6]。

為了鑒定引起高羊茅斑塊狀枯死的原因，本研究調(diào)查北京市高麗營鎮(zhèn)種植高羊茅的土壤，對高羊茅根際優(yōu)勢植物寄生線蟲進行分離；并進一步通過形態(tài)學結(jié)合分子生物學方法對該線蟲進行鑒定，以期明確該線蟲的種類，為進一步防治該病害提供基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

樣品土壤采集于北京市順義市高麗營鎮(zhèn)草地，時間為2014年6月；采集選取長勢較弱，出現(xiàn)斑點枯萎的高羊茅草坪草，收集其根際土及草根；采樣點面積約1萬m2，采取“Z”字形多點取樣法，收集距地表15 cm左右深度的土樣；每個樣品(土壤+草根)鮮重袋為1 kg，含有20個采樣點混合均勻的土樣，每個采樣點50 g土樣。

1.2 線蟲的分離

土壤線蟲的分離采用貝爾曼漏斗法分離[7]，即取直徑約20 cm的連接一段乳膠管的漏斗，用止水夾控制膠管關閉；漏斗內(nèi)先注入2/3的清水后，取高羊茅根際土樣200 g，用兩層紗布包住土樣并輕放于漏斗中，使水漫過，浸透；待24 h后，取潔凈的玻璃器皿收集10 mL分離獲得的線蟲懸浮液。

1.3 線蟲形態(tài)學鑒定

在顯微鏡下挑出形態(tài)大小一致的線蟲置于滴有少許蒸餾水的載玻片上，用酒精燈加熱2～3 s殺死線蟲；然后將線蟲依次用挑針排列整齊，蓋上蓋玻片，用指甲油封片[8]。于光學顯微鏡下對線蟲形態(tài)及其內(nèi)部特征觀察、測量和拍照。最后，從中隨機選取10條成蟲，用Deman公式[8]對挑取的被測成蟲進行形態(tài)測計。

1.4 線蟲的分子鑒定

1.4.1 單條線蟲DNA的提取 根據(jù)王江嶺等[9]的方法，取200 μL的PCR管，內(nèi)置5 μL 10× PCR buffer與10 μL超純水，并將經(jīng)過dd H2O反復漂洗的線蟲挑入PCR管中。先將PCR管置于離心機中離心120 s，然后液氮冷凍PCR管底2～3 min、85 ℃加熱2.5 min后，向管中加入1 μL的蛋白酶K，將PCR管置入PCR儀中56 ℃、30 min，95 ℃、10 min；最后將PCR管置于離心機12 000 r·min-1離心120 s，離心過后取上清液直接用于PCR擴增。

1.4.2 PCR擴增 線蟲DNA的PCR擴增方法見De Luca和Reyes[10]的報道。反應在mastercycler(Eppendorf)上進行,ITS區(qū)序列擴增反應體系(50 μL)：10×PCR buffer 5 μL，10 mmol·L-1dNTP 1 μL，10 μmol·L-1的上/下游引物各3 μL，5 U· μL-1Taq DNA聚合酶0.6 μL，線蟲粗提液5 μL ，加純凈水定容至50 μL。

ITS區(qū)序列上游引物為ITS1：5’-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3’，下游引物為ITS2：5’-GCTGCGTTCTTCATCGAT-3’[11-12]；反應條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，36個循環(huán)；72 ℃，8 min。

28S rDNA D2D3區(qū)序列上游引物為D2A：5’-ACAAGTACCGTCAGGGAAAGTGG-3’，下游引物為D3B：5’-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3’[13]；反應條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，37個循環(huán)；72 ℃，8 min。

PCR結(jié)束后，取5 μL產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳25 min，采用凝膠成像系統(tǒng)成像，觀察電泳結(jié)果，拍照并記錄。挑取陽性條帶的產(chǎn)物于北京六合通公司測序。將測序的結(jié)果在GenBank中進行同源性比對，并從比對的結(jié)果中分別選取同源性較高的18種短體屬線蟲的rDNA ITS區(qū)和15種短體屬線蟲的D2D3區(qū)序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，選取Bursaphelenchusxylophilus序列作為外群(Outgroup)對照，并通過軟件MEGA4.1，選用臨接法(Neighbor-Joining)距離模型進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，并應用自展法(Bootstrap)檢驗系統(tǒng)樹的可靠性，自展數(shù)據(jù)集為800次[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學鑒定

2.1.1 形態(tài)學描述 通過在顯微鏡下觀察高羊茅草坪草根際分離的線蟲形態(tài)發(fā)現(xiàn)(圖1)，雌蟲溫熱殺死后體略向腹面彎曲；側(cè)區(qū)4條側(cè)線，中間寬，兩邊窄，從口針基球延伸到尾端；唇區(qū)較低，唇環(huán)兩條，基環(huán)高于頂環(huán)，唇區(qū)縊縮明顯；頭架發(fā)達，深度骨化；口針發(fā)達，口針基部球圓形，長15～16 μm；中食道球卵圓形，寬約占該處體寬的2/3；食道腺從腹面和側(cè)面覆蓋腸的前端；陰門偏前，V值為77%～79%；排泄孔在食道一腸瓣門的前方；后尾端光滑無紋，尾環(huán)數(shù)為18～19。未發(fā)現(xiàn)雄蟲。

圖1 草坪草根際短體線蟲形態(tài)圖Fig.1 Morphological photographs of Pratylenchus from turfgrass

注:A，陰門；B，頭部；C，尾部；D，雌蟲成蟲；E，食道。

Note: A, vulva； B, stylet； C, tail; D, femail adult; E, oesophagus.

2.1.2 形態(tài)測計值 從北京市順義區(qū)高羊茅草坪草根際分離的短體線蟲，形態(tài)特征和測計值與Loof[15]和Hashim[16]等的描述最為接近(表1)。故初步將其鑒定為斯克里步納短體線蟲Pratylenchusscribneri。

2.2 分子生物學特征

2.2.1 rDNA ITS區(qū)序列特征 分別將3條線蟲的PCR產(chǎn)物進行測序[17]。除去兩端18S和28S序列后，得到片段大小約為750 bp的3條序列[17]。將3條序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的序列比對后發(fā)現(xiàn)，這3條線蟲的ITS區(qū)序列與Pratylenchusagilis(編號為JQ039330)及P.scribneri(編號為JX04693)序列相似度為93%(目前業(yè)內(nèi)已經(jīng)認同P.agilis與P.scribneri為同一種類的同物異名[18])，本研究將這兩種按同一種類處理)。系統(tǒng)發(fā)育分析也可以看出(圖2)，本研究發(fā)現(xiàn)的短體線蟲種類與P.scribneri聚為一組。

2.2.2 D2D3區(qū)序列特征 分別將4條線蟲的PCR產(chǎn)物進行測序，得到D2D3區(qū)序列片段長度約為760 bp的4條序列，通過NCBI比對，與編號為JX047002、Eu130865、AF170444、DQ498832的P.scribneri序列相似度為97%～99%；系統(tǒng)發(fā)育分析與ITS 區(qū)分析結(jié)果基本一致，4條序列都聚在P.scribneri組群中，與其他種短體線蟲差異明顯(圖3)。

表1 Pratylenchus北京群體與已報道種群測計值比較

注：n為數(shù)量;L為體長(mm)；a為體長/最大體寬；b為體長/體前端至食道與腸連接處的距離；b’為體前端至食道腺末端的距離；c為體長/尾長；c’ 為體長/肛門處體寬；V為體前端至陰門的距離×100/體長； St為口針(μm)。

Note: n, number; L, body length(mm); a, body length/maximum body width; b, body length/the distance from body front to esophagus and intestines junction; b’, the distance of body front to the end of the esophagus gland; c, body length/tail length; c’, body length/ anus body width; V, the distance of body front to vulva×100/body length; St, stylet (μm).

圖2 基于rDNA ITS 區(qū)序列的臨接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic relationships tree by Neighbor-Joining (NJ) using ITS rDNA sequences

注：圖中1,2,3為本研究基于rDNA ITS 區(qū)序列所獲得的線蟲序列編號。

Note: The 1,2,3 sequence number of nematode were obtained by using ITS rDNA sequences in the research.

圖3 基于rDNA D2D3區(qū)序列的臨接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic relationships tree by Neighbor-Joining (NJ) using D2D3 rDNA sequences

注：圖中1,2,3,4為本研究基于rDNA D2D3區(qū)序列所獲得的線蟲序列編號。

Note: The 1, 2, 3, 4 sequence number of nematode were obtained by using D2D3 rDNA in the research.

通過Blast和系統(tǒng)進化分析，進一步驗證了形態(tài)學鑒定的結(jié)果，該線蟲為斯克里步納短體線蟲P.scribneri。

3 討論與結(jié)論

近幾年來，全國對生態(tài)保護、環(huán)境建設和城市綠化美化的關注持續(xù)增加。而作為重要物質(zhì)基礎的牧草和草坪草種子，其需求量逐年增加。植物寄生線蟲作為植物主要病原物之一，其對植物的危害程度超過細菌和病毒，僅次于真菌病害。據(jù)統(tǒng)計，植物線蟲病每年約造成1 000億美元的損失，損失率高達12.3%[19]。植物寄生線蟲不僅對寄生植物造成直接危害，而且也可直接傳播細菌和病毒，對農(nóng)林業(yè)的生產(chǎn)造成巨大危害，成為制約農(nóng)林業(yè)發(fā)展的主要因素。我國目前對于草坪草的植物線蟲病害的研究仍不夠深入，包括對草坪中的植物線蟲的種類鑒定，而植物病原線蟲的準確鑒定是植物病害高效治理的前提。相比之下，國外針對植物線蟲的病害研究相對深入，早在19世紀初就將植物線蟲病害作為主要的植物病害之一[8]，并通過對草坪線蟲的種類鑒定來達到草坪病害的預防和防治的目的。本研究在北京市順義區(qū)高羊茅首次發(fā)現(xiàn)了斯克里步納短體線蟲P.scribneri，可以為今后的線蟲防治工作提供可靠的理論依據(jù)。

斯克里步納短體線蟲P.scribneri屬短體線蟲屬中分布相對廣泛的種類之一。該屬線蟲主要危害植物根系部位，在植物根系部位取食，并通過傷口引起其他真菌、細菌病害的復合侵染，嚴重時會引起根系的腐爛，導致植物死亡。該屬線蟲寄主范圍廣，而且世代短、繁殖快，不易被識別，該線蟲造成的危害不可小覷。Loof[15]、Thorne和Malek[20]、Loof[21-22]、高學彪等[23-24]、段玉璽等[25]先后對其進行過描述。已有的報道表明，該線蟲在我國的寄主主要為大豆(Glycinemax)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、高粱(Sorghumvulgare)、小米(Panicummiliaceum)、小麥(Triticumaestivum)、番茄(Solanumlycopersicum)和油菜(Brassicacampestris)等[11]，但寄生在草坪草根部的斯克里步納短體線蟲目前尚無報道。

本研究從高羊茅草坪草根際分離得到的短體線蟲種群，其形態(tài)及測計值與斯克里步納短體線蟲最為接近，其D2D3區(qū)序列比對顯示與GenBank中已登記的多條Pratylenchusscribneri序列相似度為97%～99%，系統(tǒng)進化距離較近，顯示其為斯克里步納短體線蟲，但與此同時，ITS區(qū)序列比對結(jié)果顯示其與已登記的P.scribneri種類也存在一定的差異，這可能屬于地理種群或不同寄主生境下的種群變異，筆者將針對此做后續(xù)研究。

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(責任編輯 武艷培)

Identification and separation ofPratylenchusfrom root ofFestucaelata

CHEN Yan1, GAO Li-yuan1, MA Teng2, GAO Wen-na2, HE Jia1, LIU Xing-liang2, GUO Wei1, BIAN Yong2

(1.Beijing university of Agriculture, Beijing 102206, China； 2.Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026, China)

Festucaelatais one of turfgrass species with longer green period and is very important in the construction of ecological environment. However, some diseases frequently occur and bring heavy economical loss to the lawn with the extended of tall fescue growing regions. In the present paper, an investigation about the reasons of dead patches in tall fescue lawn in Beijing's Gaoliying Town suggested that the predominant parasitic nematodes of tall fescue's rhizosphere were the primary cause of mortality. The parasitic nematodes isolated from tall fescue using the Behrman funnel method were short body nematodes with over 100 per 100 mL soil samples of population density. The parasitic nematodes were further identified asPratylenchusscribneribased on morphology characteristics including esophagus, lip annulus, spermatheca, stylet length and V value. The internal transcribed spacer (ITS) region of rDNA was amplified from genomic DNA and sequenced. The sequence had 93% similarity with the species ofP.agilisandP.scribneriin Genebank which confirmed the nematode wasP.scribneri. To best of our knowledge, this is the first report thatP.scribnericause tall fescue patchy disease in China.

Festucaelata;Pratylenchusscribneri; separation; identification

GUO Wei E-mail:guowei@hebau.edu.cn BIAN Yong E-mail:biany@bjciq.gov.cn

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0447陳艷，高利媛，馬騰，高文娜，賀佳，劉興亮，郭巍，邊勇.高羊茅根際一種短體線蟲的分離與鑒定[J].草業(yè)科學,2015,32(6):988-993.

2014-10-08 接受日期：2015-01-12

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目“進境牧草種子真菌篩查技術研究初探”(2015IK021)；北京出入境檢驗檢疫局科技計劃項目“北京地區(qū)進境植物繁殖材料隔離檢疫模式適用與推行初探”(2013BK008)；北京市農(nóng)業(yè)技術試驗示范項目(20140128)

陳艷(1972-)，女，陜西西安人，講師，博士，主要從事植物保護研究。E-mail:cheny@bua.edu.cn共同

第一作者：高利媛(1993-)，女，北京人，在讀本科生，主要從事植物保護研究。E-mail:708859234@qq.com

郭巍(1971-)，女，黑龍江綏化人，教授，博導,博士，主要從事植物保護研究。E-mail:guowei@hebau.edu.cn邊勇(1981-)男，陜西延安人，農(nóng)藝師，碩士，主要從事植物線蟲檢疫工作。E-mail：biany@bjciq.gov.cn

S435.4

A

1001-0629(2015)06-0988-06

CHEN Yan,GAO Li-yuan,MA Teng,GAO Wen-na,HE Jia,LIU Xing-liang,GUO Wei,BIAN Yong.Identification and separation ofPratylenchusfrom root ofFestucaelata[J].Pratacultural Science，2015,32(6)：988-993.