超高效液相色譜法測定半夏不同炮制品中核苷類成分含量*

何丹，楊林，秦少容，張景勍

超高效液相色譜法測定半夏不同炮制品中核苷類成分含量*

何丹1，楊林2，秦少容3，張景勍1

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016；2.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，重慶 401331；3.太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司，重慶 408000)

目的 建立以超高效液相色譜(UPLC)法測定不同炮制工藝半夏中尿苷、鳥苷和腺苷含量的方法。 方法 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動相為水-甲醇，梯度洗脫，柱溫30 ℃，流速0.5 mL·min-1，檢測波長254 nm。 結(jié)果 尿苷在2.214～22.140 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=93 991X-1 653(r=0.999 9)，平均回收率為99.18%，RSD=2.40%；鳥苷在1.212～12.120 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=61 542X-806(r=0.999 9)，平均回收率為98.88%，RSD=1.16%；腺苷在0.245 2～2.452 0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=14 994X-145(r=0.999 9)；平均回收率為98.66%，RSD=0.97%。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、快速，能有效地測定不同炮制工藝半夏中尿苷、鳥苷和腺苷的含量。

半夏；炮制工藝；核苷；色譜法，超高效液相

半夏為天南星科植物半夏[Pineliaternate(thumb.)Breit.]的干燥塊莖，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性溫，味辛，有小毒，歸脾、胃、肺經(jīng)。具有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結(jié)之功效[1]。半夏含有有機酸類、核苷類、生物堿類等化學(xué)成分[2]。生半夏有一定的毒性，內(nèi)服需炮制后使用。根據(jù)不同的炮制工藝，炮制品又分為姜半夏、清半夏和法半夏等多種?！吨腥A人民共和國藥典》2010年版規(guī)定半夏及清半夏藥材的質(zhì)量控制均采用電位滴定法測定其總有機酸的含量[1]，以琥珀酸量計算。目前關(guān)于半夏含量測定的文獻報道有生物堿類成分[3]、有機酸[4]、氨基酸[5]、核苷[6]和多糖[7]成分的測定。其中核苷類成分是半夏藥材中較為重要有效成分，含量較高的有尿苷、鳥苷和腺苷[8]。而報道的對半夏藥材及飲片中核苷類成分的測定多采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)法和毛細管電泳法。HPLC法測定時間長，毛細管電泳法用內(nèi)標(biāo)法，操作繁瑣[9-11]。筆者目前未見采用超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)法對不同炮制工藝半夏藥材中核苷類成分進行測定比較的報道，故采用UPLC法進行了相關(guān)研究。該方法快速、準(zhǔn)確，重復(fù)性和精密度良好，能夠為半夏及不同炮制品的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC(美國Waters公司)；ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色譜柱(美國Waters 公司)；AG 135型電子分析天平(瑞士Mettler toledo公司)。

1.2 試藥 半夏藥材(甘肅天水，經(jīng)重慶太極集團質(zhì)檢部楊修齊研究員鑒定為天南星科植物半夏Pinelliaternata的干燥塊莖)；尿苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110887-200202)；鳥苷對照品(上海同田生物有限公司，含量：98%，批號：12111835)；腺苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110879-200202)。甲醇(色譜級，美國默克公司)，實驗用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱溫30 ℃；流動相為水-甲醇，按表1梯度洗脫；檢測波長254 nm；流速0.5 mL·min-1；進樣量5 μL，理論板數(shù)按尿苷峰計算不低于4 000。

2.2 對照品儲備液的制備 ①精密稱取尿苷對照品22.14 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為221.4 μg·mL-1尿苷對照品儲備液。②精密稱取鳥苷對照品12.12 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為121.2 μg·mL-1鳥苷對照品儲備液。③精密稱取腺苷對照品24.52 mg，置100 mL量瓶中，加少量甲醇溶解，再加水稀釋至刻度，搖勻，得腺苷對照品儲備液。精密吸取該儲備液1 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得濃度為24.52 μg·mL-1腺苷對照品溶液。④精密吸取尿苷對照品儲備液、鳥苷對照品儲備液和腺苷對照品溶液各5 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 姜半夏：取半夏1 kg，加入飲用水浸泡72 h，8 h換水一次；加入生姜共煎，生姜用量為25%；加入8倍量水，分別90 ℃溫浸2次，第1次3 h，第2次2 h，合并減壓濃縮至510 mL。取1 mL濃縮液，加水稀釋至25 mL，經(jīng)內(nèi)徑0.22 μm微孔濾膜濾過，收集續(xù)濾液即為姜半夏供試品溶液。

清半夏：取凈半夏1.5 kg，用8%白礬水溶液浸泡，至內(nèi)無干心，口嘗微有麻舌感，取出，洗凈，干燥。篩去碎屑。取清半夏1 kg，加入8倍量水，溫浸2次(90 ℃)，第1次3 h，第2次2 h，合并減壓濃縮至510 mL。取濃縮液1 mL，加水稀釋至25 mL，經(jīng)內(nèi)徑0.22 μm微孔濾膜濾過，收集續(xù)濾液，即得清半夏供試品溶液。

法半夏：取凈半夏1.5 kg，大小分開，用水浸泡至內(nèi)無干心。取甘草225 g，加水煎煮2次，合并煎液，倒入用生石灰150 g制成的石灰液中，攪勻，加入上述已浸透的半夏，浸泡，每日攪拌1或2次，并保持浸泡液pH>12，至剖面黃色均勻，口嘗微有麻舌感時，取出，洗凈，陰干或烘干，即得。取法半夏1 kg，加入8倍量水，分別90 ℃溫浸2次，第1次3 h，第2次2 h，合并減壓濃縮至510 mL。取濃縮液1 mL，加水稀釋至25 mL，經(jīng)內(nèi)徑0.22 μm微孔濾膜濾過，收集續(xù)濾液即為法半夏供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品溶液1，2，4，6，8，10 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對照品溶液。按“2.1”項色譜條件測定，以峰面積(Y)對濃度(X，μg·mL-1)進行線性回歸。尿苷的回歸方程為：Y=93 991X-1 653(r=0.999 9)；鳥苷的回歸方程為：Y=61 542X-806(r=0.999 9)；腺苷的回歸方程為：Y=14 994X-145(r=0.999 9)。結(jié)果表明，尿苷濃度在2.214～22.140 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；鳥苷濃度在1.212～12.120 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；腺苷濃度在0.245 2～2.452 0 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實驗 按樣品溶液制備色譜條件制備清半夏樣品溶液，按“2.1”項方法連續(xù)進樣6次，測定峰面積。結(jié)果尿苷、鳥苷和腺苷的RSD分別為0.55%，1.28%和1.36%，符合精密度實驗要求。

2.6 穩(wěn)定性實驗 按樣品溶液制備方法制備清半夏樣品溶液，室溫下放置0，1，2，4，6，8 h，按“2.1”項下色譜條件分別進樣5 μL測定峰面積。結(jié)果峰面積基本不變，尿苷、鳥苷和腺苷的RSD分別為0.65%，0.71%和0.88%，表明溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實驗 按樣品溶液制備方法平行配制清半夏樣品6份，按“2.1”項下方法進樣分析，按外標(biāo)法以峰面積計算含量，尿苷、鳥苷和腺苷的平均含量分別為55.3，43.0和2.17 μg·g-1，RSD分別為0.88%，1.01%和0.93%。

2.8 加樣回收率實驗 取已測知含量的清半夏提取物，分別精密量取5 mL，共27份，置10 mL量瓶中，分別精密加入提取物中尿苷、鳥苷和腺苷含量約80%，100%和120%的對照品儲備液，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，按“2.1”項下色譜條件進樣5 μL，按外標(biāo)法計算回收率。結(jié)果尿苷、鳥苷和腺苷的平均回收率分別為99.18%，98.88%和98.66%，RSD分別為2.40%，1.16%和0.97% 。

2.9 不同炮制工藝半夏藥材含量測定 取不同炮制工藝半夏供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件測定，以峰面積代入線性方程計算，3種半夏中尿苷、鳥苷和腺苷的含量結(jié)果見表2，色譜圖見圖1。

3 討論

半夏因其味辛辣、麻舌而刺喉，具有“戟人咽”的刺激性，被列為有毒中藥。因此應(yīng)用時一般要有去毒的炮制過程。采用各種不同的炮制方法，既能降低半夏的毒性，又能擴大半夏的應(yīng)用范圍。臨床使用多以炮制品入藥，主要有清半夏、姜半夏、法半夏。現(xiàn)代研究認為半夏毒性主要表現(xiàn)為強烈的刺激性，主要由草酸鈣針晶引起，由于草酸不溶于水和各種有機溶劑，但能夠溶于酸、堿性溶液，而炮制輔料白礬和石灰水則分別呈一定的酸、堿性，因此炮制后草酸鈣針晶被不同程度破壞，降低半夏的毒性，使其刺激性降低或消失[12]。

表2 不同炮制工藝半夏核苷含量測定

A.混合對照品溶液；B.清半夏；C.法半夏；D.姜半夏；1.尿苷；2.鳥苷；3.腺苷

A.mix standards solution；B.clearPinelliaternate；C.rhizomaPinelliaepraeparatum；D.gingerPinelliaternate；1.uridine；2.guanosine；3.adenosine

Fig.1 UPLC chromatogram of nucleosides inPinelliaternatawith different processing

半夏及清半夏的質(zhì)量控制方法，《中華人民共和國藥典》2010年版中采取電位滴定法對醇提取物中有機酸總量(以琥珀酸含量計算)進行含量測定，姜半夏和法半夏還沒有規(guī)定含量測定項目[1]。半夏及清半夏藥材質(zhì)量控制指標(biāo)是有機酸類化合物總量，沒有具體的指標(biāo)成分，且滴定法相對干擾因素較多。對半夏藥材及其炮制品中水提取物的質(zhì)量控制沒有明確規(guī)定，但核苷的藥理活性明確，在半夏藥材中含量也較高，從本實驗結(jié)果看，清半夏中3種核苷的總含量高達100 μg以上，同時不同的半夏炮制品核苷成分含量差異也較大。因此建立核苷類成分的測定方法對于半夏及炮制品的質(zhì)量控制具有重要參考意義。

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Determination of the Content of Nucleosides in Differently ProcessedPinelliaternataby UPLC

HE Dan1, YANG Lin2, QIN Shaorong3, ZHANG Jingqing1

(1.CollegeofPharmacy,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 2.DepartmentofPharmacy,ChongqingMedicalandPharmaceuticalCollege,Chongqing401331,China; 3.TaijiChongqingFulingPharmaceuticalGroupCo.LTD,Chongqing, 408000,China)

Objective To establish an ultra-performance liquid chromatography (UPLC) method for detecting content of uridine, guanosine and adenosine inPinelliaternata. Methods Acquity UPLC Ben C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm) was used.The mobile phase was methanol and water by gradient elution mode, and the column temperature was 30 ℃.The flow rate was 0.5 mL·min-1and the detection wavelength was 254 nm. Results The linear range of uridine was 2.214-22.14 μg·mL-1.The regression equation wasY=93 991X-1 653 (r=0.999 9).The linear range of guanosine was 1.212-12.12 μg·mL-1, and the regression equation wasY=61 542X-806 (r=0.999 9).The linear range of adenosine was 0.245 2-2.452 0 μg·mL-1, and the regression equation wasY=14 994X-145 (r=0.999 9).The average recovery was 99.18% (RSD=2.40%), 98.88% (RSD=1.16%) and 98.66% (RSD=0.97%) for uridine, guanosine and adenosine, respectively. Conclusion The method is rapid, reliable and can be used to determine nucleosides inPinelliaternate.

Pinelliaternate; Processing; Nucleosides; Chromatography, ultra-performance liquid

2014-01-10

2014-03-20

*國家科技支撐計劃(2011BAI13B03)

何丹(1977-)，女，四川達州人，副教授，在讀博士 ，主要從事中藥分析研究。電話：(0)15310985850，E-mail：ildoctor@163.com。

張景勍(1973-)，女，重慶人，研究員，博士 ，主要從事藥物制劑研究。電話：(0)13308300303，E-mail：zjqrae01@163.com。

R282.71；R927.2

B

1004-0781(2015)02-0231-04

DOI 10.3870/yydb.2015.02.025