白三烯A4水解酶及其抑制藥研究進(jìn)展*

楊堯，周瑤，郁彭，滕玉鷗

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

白三烯A4水解酶及其抑制藥研究進(jìn)展*

楊堯，周瑤，郁彭，滕玉鷗

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

白三烯是從花生四烯酸代謝產(chǎn)物中分離得到的具有共軛三烯結(jié)構(gòu)的二十碳不飽和酸，白三烯A4水解酶是水解白三烯A4產(chǎn)生白三烯B4的關(guān)鍵酶,具有環(huán)氧化物水解酶及氨肽酶雙重活性。白三烯B4是許多急性和慢性炎癥的重要化學(xué)遞質(zhì)，廣泛參與諸多炎癥性疾病的發(fā)生。除了在炎癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色，近期的研究表明，白三烯A4水解酶與多種惡性腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)。因此，新型白三烯A4水解酶抑制藥的研發(fā)工作對(duì)研制新型抗炎抗腫瘤藥物具有十分重要的意義。該文就白三烯A4水解酶及其抑制藥的研究進(jìn)展作一綜述。

白三烯A4水解酶抑制藥；白三烯A4；白三烯A4水解酶

花生四烯酸代謝是一個(gè)在生物體內(nèi)廣泛存在并具有強(qiáng)大生物活性的代謝體系，花生四烯酸代謝主要有兩條路徑：①在環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)作用下生成各種前列腺素(prostaglandin，PGs)；②在脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)作用下生成白細(xì)胞三烯(leukotrienes，LTs)、脂質(zhì)過(guò)氧化物。其中代謝途徑中的白三烯A4水解酶(leukotriene A4 Hydrolase，LTA4H)、磷脂酶A2 (phospholipase A2，PLA2)、COX、5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)等是抗炎藥物設(shè)計(jì)的重點(diǎn)靶標(biāo)。

LTs是從花生四烯酸代謝產(chǎn)物中分離得到的具有共軛三烯結(jié)構(gòu)的二十碳不飽和酸，LTA4H是水解白三烯A4(leukotriene A4，LTA4)產(chǎn)生白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)的關(guān)鍵酶，具有環(huán)氧化物水解酶及氨肽酶雙重活性。LTB4是許多急性和慢性炎癥的重要化學(xué)遞質(zhì)，廣泛參與諸多炎癥性疾病的發(fā)生。除了在炎癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色，近期的研究表明，LTA4H與多種惡性腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)。因此，新型LTA4H抑制藥的研發(fā)工作對(duì)研制新型抗炎抗腫瘤藥物具有十分重要的意義。

1 LTA4H

LTA4H存在于多種哺乳類動(dòng)物組織細(xì)胞質(zhì)中。其生物活性是催化5-(s)-反-5、6-環(huán)氧-7、9-反-11、14-順-廿碳四烯酸(LTA4)生成5(S)，12(R)-三羥-6、14順8、10-反廿碳四烯酸(LTB4)。1984年RADMARK等首先從人白細(xì)胞中提取此酶獲得成功[2]。隨后有些作者分別從大鼠白細(xì)胞和人紅細(xì)胞中提取了此酶。由于LTB4具有強(qiáng)大的白細(xì)胞趨化作用，促進(jìn)白細(xì)胞集聚和附著，促進(jìn)白細(xì)胞溶酶體內(nèi)酶的釋放和白細(xì)胞過(guò)氧化物的生成。目前認(rèn)為L(zhǎng)TB4和炎癥、過(guò)敏等關(guān)系密切。因此研究LTA4H的活性在生物醫(yī)學(xué)研究中越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

1.1 LTA4H的結(jié)構(gòu) LTA4H是一種由610個(gè)氨基酸分子組成的含鋅的雙功能金屬蛋白酶，廣泛存在于包括細(xì)菌在內(nèi)的多種生物中，并且是M1家族同源序列的成員。其晶體結(jié)構(gòu)于2001年確定，其活性特點(diǎn)是：①埋于蛋白質(zhì)深處的活性中心有一個(gè)小的開(kāi)口，溶劑可由此處滲入；②有3個(gè)水分子處于活性中心的疏水口袋端；③活性中心的親水部分附近有鋅原子與周圍水分子以螯合物形式存在；④活性中心的疏水袋以L形的空間構(gòu)型與親水端相連[3]。

1.2 LTA4H的作用機(jī)制 LTA4H具有環(huán)氧化物水解酶及氨肽酶雙重活性。環(huán)氧化物水解酶催化LTA4生成LTB4；氨肽酶的立體結(jié)構(gòu)中疏水性腔穴和二價(jià)鋅離子能催化蛋白質(zhì)和多肽底物氨基端的裂解[4-5]。

從LTA4H晶體結(jié)構(gòu)及其定點(diǎn)突變研究看出，特定位點(diǎn)的氨基酸與LTA4H的水解酶及氨肽酶的活性有關(guān)。鋅離子(Zn2+)及氨基酸Glu271、Glu296和Tyr383會(huì)影響其氨肽酶活性；Zn2+及Glu271，Arg563，Asp375，Glu296會(huì)影響其水解酶活性。

1.2.1 LTA4H在炎癥發(fā)生過(guò)程中的作用 LTA4H能夠催化LTA4產(chǎn)生LTB4，LTB4是體內(nèi)產(chǎn)生的最強(qiáng)的白細(xì)胞趨化因子之一，僅以納摩爾濃度即可激發(fā)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附、聚集，誘導(dǎo)溶酶體酶與活性氧釋放，介導(dǎo)血管損傷，參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡皮膚、關(guān)節(jié)及腎臟等組織的炎癥反應(yīng)及組織損傷。

1.2.2 LTA4H在腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用 近年來(lái)，在炎癥中扮演重要角色的LTA4H被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)，LTA4H與慢性炎癥相關(guān)的癌變機(jī)制可能有兩種：①炎癥細(xì)胞擴(kuò)增影響受體和下游信號(hào)分子介導(dǎo)的正反饋，從而誘發(fā)癌癥前期細(xì)胞和癌癥細(xì)胞的生成；②表皮細(xì)胞以及炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的LTB4刺激和加速癌癥前期細(xì)胞和癌癥細(xì)胞的生長(zhǎng)[6]。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌、胰腺癌、直腸癌和惡性淋巴瘤等腫瘤細(xì)胞中，LTA4H的表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞。因此人們推測(cè)，LTA4H異常表達(dá)同樣具有誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的作用。

LTA4H的氨肽酶功能已被證實(shí)能調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)。LTA4H的Glu271氨基酸殘基突變?cè)趯?dǎo)致其氨肽酶功能完全喪失的同時(shí)，LTA4H促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性也受到一定抑制。

2 LTA4H抑制藥

來(lái)源于花生四烯酸和LTA4脂氧素，脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)和脂氧素B4(lipoxin B4，LXB4)都是參與炎癥消退的抗炎性遞質(zhì)。LTB4參與炎癥等多種疾病的發(fā)生，因此抑制細(xì)胞內(nèi)LTB4活性或減少LTB4合成成為治療炎癥等多種疾病的一種手段，而作為生成LTB4的關(guān)鍵酶，LTA4H抑制藥的研究就至關(guān)重要[7-11]。

在花生四烯酸的代謝網(wǎng)絡(luò)中，5-LOX、5-脂氧合酶激活蛋白(5-lipoxygenase activating protein，F(xiàn)LAP)抑制藥及LTA4H抑制藥都可以達(dá)到減少LTB4的目的。5-LOX、FLAP抑制藥是通過(guò)減少LTA4來(lái)達(dá)到減少LTB4的目的，這樣會(huì)導(dǎo)致LTA4下游產(chǎn)物脂氧素形成減少，從而影響到與其相關(guān)的代謝網(wǎng)絡(luò)。而LTA4H抑制藥直接作用于產(chǎn)生LTB4的通路上，并不會(huì)影響其他產(chǎn)物的合成，所以LTA4H抑制藥在一定程度上優(yōu)于5-LOX或FLAP抑制藥。

2.1 底物類似物 由于LTA4自身可以作為L(zhǎng)TA4H抑制藥，所以之前抑制藥的研究主要集中在底物類似物方面。并推出了一系列環(huán)氧苯甲酸化合物及一系列帶有苯基或噻吩的LTA4類似物作為L(zhǎng)TA4H的抑制藥，在大鼠及HL-60細(xì)胞中對(duì)LTA4H有很好的抑制作用。

2.2 鋅離子螯合劑 異羥酸類及硫醇類化合物能夠抑制LTA4H環(huán)氧水解酶的活性；異羥肟酸類化合物在較低濃度時(shí)會(huì)充分抑制LTA4H活性。例如已經(jīng)報(bào)道的血管緊張肽抑制藥卡托普利(甲巰丙脯酸)能抑制環(huán)氧水解酶的活性。但由于卡托普利抑制活性較弱，所以以此為基礎(chǔ)合成了其他硫醇化合物，如N-[(2S)-3-巰基-2-甲丙酰]-L-脯氨酸衍生物相對(duì)于卡托普利有較好的水解酶抑制活性[12]。

苯丁抑制素(bestatin)是一種傳統(tǒng)的氨肽酶抑制藥，與296位保留谷氨酸的LTA4H 結(jié)合，從而抑制環(huán)氧水解酶和氨肽酶的活性；苯丁抑制素可有效地抑制大鼠和人食管腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2.3 非螯合型抑制藥 所推出的化合物包括咪唑類似物、脒類似物、氨基酸衍生物類似物、SC-57461A類似物等，以上幾種系列對(duì)重組人LTA4H及細(xì)胞中LTA4H具有很好的抑制活性。

引入功能基團(tuán)的吡咯烷或者哌啶類衍生物提高了LTA4H抑制藥的口服活性，一些含有哌啶基的化合物表現(xiàn)出了進(jìn)一步的生物學(xué)特征，并作為潛在的臨床候選化合物，其中4-羧哌啶衍生物有著較好的應(yīng)用前景。同時(shí)帶有酸或酸等電子、酯和各種酰胺類的化合物在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出了很好的口服活性。

氨基酸類的衍生物如N-烷基甘氨酸酰胺[13]，N-烷基甘氨酸酰胺類、芳基的二連胺類都是潛在的口服LTA4H抑制藥，具有很好的抑制活性。N-巰基酰胺酸的衍生物是一類新的LTA4H抑制藥，其中S-(4-二甲氨基)芐基-L-半胱氨酸的衍生物表現(xiàn)出了LTA4H抑制藥的活性并且其選擇性多于除血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶以外的其他金屬酶。同時(shí)苯環(huán)上用芳香取代基修飾可以提高抑制藥活性，選擇性同樣高于血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶。

一價(jià)陰離子和清蛋白可以激活LTA4H氨肽酶活性，但有機(jī)化合物是否能夠促使氨肽酶活性增強(qiáng)，尚有待進(jìn)一步研究。一系列二苯醚衍生物可以激活或者抑制LTA4H氨肽酶活性，但并不會(huì)影響LTA4H水解酶活性。另外，研究表明苯氧基-乙胺基的類似物是潛在LTA4H抑制藥。

2.4 新型的LTA4H抑制藥 生姜中的姜辣素是具有抗腫瘤活性的天然物質(zhì)，研究表明，姜辣素可通過(guò)抑制LTA4H來(lái)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)[14]；紅酒中的多酚類成分白藜蘆醇有良好抗腫瘤活性，繼2009年DAVIES等通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)白藜蘆醇能夠與LTA4H結(jié)合之后，OI等[15]在2010年報(bào)道，白藜蘆醇能與LTA4H結(jié)合，抑制LTB4產(chǎn)生，并控制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

香豆酮系列能夠減少小鼠和人類血液中LTB4產(chǎn)生，以香豆酮為基礎(chǔ)合成了LTA4H抑制藥。在體外實(shí)驗(yàn)，此類化合物表現(xiàn)出了LTA4H抑制藥活性和較好的藥動(dòng)學(xué)特性，采用香豆酮中心替代模式合成的化合物在體外和小鼠體內(nèi)都表現(xiàn)出較好的抑制活性。在小鼠體內(nèi)，在一定范圍內(nèi)隨著其劑量的增加，合成LTB4的量逐漸減小。此類化合物有著很好應(yīng)用前景，能夠更好地抑制人血中LTB4的產(chǎn)生，為L(zhǎng)TA4H抑制藥的合成提供了很好的基礎(chǔ)[16]。

以PLA2和LTA4H為靶位點(diǎn)的雙功能抑制藥可能會(huì)平衡花生四烯酸網(wǎng)絡(luò)并且可以用作新的抗炎癥藥物。之前的研究表明，對(duì)于hnps-PLA2和LTA4H的雙功能抑制藥已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。以此化合物為基礎(chǔ)，通過(guò)分子嵌合技術(shù)所設(shè)計(jì)的全新雙靶位點(diǎn)抑制藥，并以此為基礎(chǔ)合成5-羥基色胺等一系列化合物，在體外對(duì)兩種酶的抑制效果優(yōu)于之前的雙功能抑制藥[17]。

目前國(guó)外對(duì)于LTA4H抑制藥的研究多用于炎癥相關(guān)的傳統(tǒng)疾病及心腦血管疾病防治。由于LTA4H是完全不同于現(xiàn)有抗癌藥物靶標(biāo)的目標(biāo)蛋白，以LTA4H抑制藥作為新型抗癌藥物的研究是該領(lǐng)域新的研究方向。

3 結(jié)束語(yǔ)

LTA4H既是調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要蛋白酶，同時(shí)也可能成為具有全新作用機(jī)制的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)。通過(guò)闡明LTA4H異常表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的具體作用機(jī)制，既能為開(kāi)發(fā)具有高度特異性的高效LTA4H抑制藥的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)提供一種新思路、新靶點(diǎn)和新的技術(shù)平臺(tái)，也為臨床炎癥與癌癥的關(guān)聯(lián)研究提供新的思路。

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2013-10-13

2013-11-20

*天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃自然科學(xué)基金一般項(xiàng)目(12JCYBJC31600)

楊堯(1988-)，女，山西大同人，在讀碩士，研究方向：藥學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)。電話：(0)18322695857，E-mail：yangyao2009.cool@163.com。

滕玉鷗(1976-)，女，吉林長(zhǎng)春人，副教授，研究方向：藥學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)。E-mail：tyo201485@tust.edu.cn。

R965

A

1004-0781(2015)02-0225-03