單采血小板來源外泌體的提取與鑒定

程 福，楊 璐，李小飛，陳 潔，楊 鑫，黃遠(yuǎn)帥，汪德清

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院輸血科，四川 瀘州646000；2.中國人民解放軍總醫(yī)院輸血科，北京100853）

外泌體是一種由多種細(xì)胞分泌的納米級囊泡結(jié)構(gòu)，直徑約為30～150 nm，電鏡下常呈球狀或杯狀，廣泛存在于細(xì)胞上清，血漿、血清、尿液等體液中［1-2］，其胞內(nèi)富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA、miRNA等物質(zhì)，是細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)、信息交換的良好介質(zhì)［3］。正常生理?xiàng)l件下，循環(huán)血液中血小板來源的微粒約占所有微粒成分的70%～90%［4］，且隨著成分輸血成為腫瘤患者治療的重要手段，特別是血小板輸注在預(yù)防和治療腫瘤患者出血中發(fā)揮了重要作用，因此，開展血小板來源外泌體相關(guān)研究具有很重要的意義。因此，我們在本研究中著重探討不同保存時(shí)間和保存方式對單采血小板來源外泌體提取、鑒定的影響，以便為后續(xù)進(jìn)一步開展血小板來源外泌體研究提供穩(wěn)定可靠的方法。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

超速離心機(jī)（美國Thermo Scientific公司）；離心水平轉(zhuǎn)頭（美國Thermo Scientific公司）；透射電鏡（日本JEOL公司）；全能型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國BIORAD公司）；血小板震蕩儀（美國Forma Scientific公司）；0.22μm filter（美國Millipore公司）；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（Solarbio公司）；CD9單克隆抗體、β-actin內(nèi)參、二抗、（Bioworld Technology公司）。

2 樣本來源

單采血小板來自中國人民解放軍總醫(yī)院2017年12月獻(xiàn)血員標(biāo)本，檢驗(yàn)合格后于血小板震蕩儀上22℃震蕩保存，備用。

3 樣本處理

選取當(dāng)天采集的某一單采血小板樣本，均分于四個(gè)血小板保存袋中，標(biāo)為A、B、C、D。A袋樣本在血小板震蕩儀上放存1天后即刻提取其外泌體；B袋樣本在血小板震蕩儀上放存5天后即刻提取其外泌體；C袋樣本在血小板震蕩儀上放存5天后，離心去掉血小板（2000g，30min，4℃），放-80℃凍存1周后提取其外泌體；D袋樣本在血小板震蕩儀上放存5天后，離心去掉血小板，混入5% DMSO放-80℃凍存1周后提取其外泌體。

4 外泌體提取

取30mL血小板樣本于離心管，4℃，2000g，離心30min，去除大部分血小板；轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中，4℃，10000g，離心30min，去除殘余血小板；轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中，4℃，105000g，離心2h，棄掉上清，并用1mL PBS重懸沉淀；0.22μm濾膜過濾上一步沉淀重懸液，并用PBS補(bǔ)足液體至離心管總體積，4℃，105000g，離心2h；棄掉上一步上清液，并用300ulPBS重懸沉淀，-80℃保存。

5 外泌體鑒定

5.1 透射電鏡檢測外泌體形態(tài)及大小 取分離提取的外泌體各20μL重懸液于塑料薄膜上，將銅網(wǎng)（芳華膜）倒扣在液滴表面，靜置10min，用濾紙緩慢吸干液體，轉(zhuǎn)移銅網(wǎng)至1%戊二醛液滴上負(fù)染5min，用濾紙緩慢吸干液體并用雙蒸餾水液滴洗滌銅網(wǎng)3次，3min／次，再用濾紙緩慢吸干銅網(wǎng)上液體并將其置于白熾燈下照射10min左右以使銅網(wǎng)表面液體充分干燥，轉(zhuǎn)移銅網(wǎng)至樣品桿上樣區(qū)，并于-80KV透射電鏡下觀察。

5.2 免疫印跡法驗(yàn)證 取分離提取的外泌體各20μL，加入等體積的RIPA細(xì)胞裂解液（含1%PMSF），冰上裂解30min，12000rpm離心5min，取上清液加入適量的4×蛋白上樣緩沖液，煮沸10min；取處理后外泌體樣本各10μL于12%SDS-PAGE凝膠上電泳（先80V恒壓電泳30min，再120V恒壓電泳約1h），結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，并200mA恒流轉(zhuǎn)膜80min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2h，再加入CD9（1∶1000）單克隆抗體、β-actin，4℃搖床過夜。TBST洗膜4次，10min／次，再加入二抗（1∶5000），搖床上孵育1h，再TBST洗膜4次，10min／次，加適量ECL化學(xué)發(fā)光液于膜上，并用全能型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)分析。

5.3 外泌體總蛋白濃度測定 外泌體富含蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵結(jié)構(gòu)在堿性環(huán)境下能與Cu2+生產(chǎn)絡(luò)合物，并將Cu2+還原成Cu+，而BCA試劑可敏感特異地與Cu+結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色的復(fù)合物，并在562nm處有最大光吸收值，該復(fù)合物顏色與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)光吸收值的大小來測定蛋白質(zhì)含量，從而間接反映各實(shí)驗(yàn)組的外泌體產(chǎn)量高低。具體操作方法為：取分離提取的外泌體各20μL，并分別加入20μL RIPA細(xì)胞裂解液（含1%PMSF），冰上裂解30min，12000rpm離心5min；分別取25μL新鮮配置的BSA標(biāo)準(zhǔn)液和處理后外泌體樣本，加入到96孔板中；再每孔加入200μL新鮮配置的BCA工作液；加蓋，37℃孵育30min；在562nm處檢測各孔吸光度值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算外泌體樣本中蛋白濃度。

結(jié) 果

1 不同保存時(shí)間的單采血小板來源外泌體

不同保存時(shí)間的單采血小板來源外泌體，結(jié)果見圖1。

圖2 比較不同樣本保存方式對外泌體提取產(chǎn)量及鑒定的影響

討 論

目前，外泌體的提取方法包括超速離心法、超濾法、免疫磁珠法、PEG-based沉淀法、ExoQuickTM試劑盒等［5-7］，其中以超速離心法最為常用。相比于試劑盒法、免疫磁珠法，超速離心法耗時(shí)費(fèi)力、外泌體回收率不高，但其提取純度可靠、提取量大，且操作簡單、成本較低，因此，對于初次接觸外泌體領(lǐng)域的研究者而言，超速離心法無疑可以作為首選。所以，本研究僅針對超速離心法提取單采血小板來源外泌體的影響因素做了相關(guān)探討，而未對其他方法進(jìn)行研究。

外泌體是一種可由多種細(xì)胞通過胞吐形式釋放到細(xì)胞外環(huán)境的納米級雙層膜囊泡，其形態(tài)規(guī)則，常呈球狀或杯狀，且不同來源的外泌體通常存在特異性表達(dá)的蛋白，比如HSP70、HSP90熱休克蛋白，及CD9、CD81、CD63四跨膜蛋白超家族等［8］，這些外泌體標(biāo)志蛋白常被用來作為外泌體鑒定的依據(jù)，因此，外泌體的鑒定除了利用電鏡觀察直接觀察形態(tài)、大小，通常還可以借助免疫印跡技術(shù)或者流式細(xì)胞儀檢測其表面特異性表達(dá)蛋白。本研究中，我們首先利用透射電鏡直接觀察外泌體，然后借助免疫印跡技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果提示鏡下可觀察到直徑約30～150nm茶托狀的雙層膜囊泡，且免疫印跡法檢測到外泌體特異性表達(dá)的CD9分子，這證實(shí)了本研究采用的超速離心法模式可有效提取到外泌體。

外泌體提取過程中，除了考慮純度的影響因素，提取產(chǎn)量也是不容忽視的問題，為了探討超速離心法提取外泌體過程中常常影響提取產(chǎn)量的因素，我們首先研究了不同保存時(shí)間對血小板來源外泌體的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)保存5天的單采血小板的外泌體產(chǎn)量明顯高于保存1天的單采血小板的外泌體產(chǎn)量，這可能是因?yàn)殡S著血小板保存時(shí)間延長，其釋放的外泌體含量逐漸升高，與前期相關(guān)報(bào)道的結(jié)論相符合：即室溫保存的單采血小板，隨著保存時(shí)間的延長血小板活化增多，微粒釋放增多［9］。

在實(shí)際科研工作中，凍存樣本常常是一項(xiàng)必要的操作，但凍存處理標(biāo)本是否會對外泌體提取、鑒定造成影響至今暫無報(bào)道。因此，本研究中，我們對同一標(biāo)本分別進(jìn)行未凍存處理、凍存處理、加入凍存保護(hù)劑后再凍存處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，凍存處理標(biāo)本會明顯降低其外泌體提取產(chǎn)量，這可能是由于外泌體是雙層膜囊泡結(jié)構(gòu)，在凍融過程中可能會導(dǎo)致部分外泌體破裂，而超速離心法不易離心得到破碎后的外泌體，從而使得外泌體的提取產(chǎn)量有所降低，電鏡觀察結(jié)果也表明凍存標(biāo)本的外泌體在鏡下不易找到視野，且形態(tài)相對不典型，這也證實(shí)了凍存處理會對外泌體的形態(tài)造成一定影響。DMSO常常作為細(xì)胞凍存液的成分之一，且研究表明，向冰凍血小板中加入5%～6%的DMSO可一定程度上保護(hù)血小板，提高其質(zhì)量［10］，因此，我們嘗試向凍存的標(biāo)本加入一定量DMSO，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入5%DMSO后，其外泌體提取產(chǎn)量有所提高，且形態(tài)相對有所改善。

綜上，本研究有效地建立了適用于血小板來源外泌體提取的超速離心法模式，且對影響外泌體提取產(chǎn)量和鑒定的常見因素做出了明確的評估，為后續(xù)開展血小板來源外泌體研究奠定了基礎(chǔ)。