應用FITC系統(tǒng)建立雌二醇直接競爭化學發(fā)光免疫分析方法

潘國華

（北京北方生物技術(shù)研究所有限公司，北京100076）

雌二醇（estradiol，E2）分子式C18H24O2，在女性雌激素中是生物學活性最強的，主要是促進子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋称谝约按龠M女性第二性征的發(fā)育。女性體內(nèi)雌二醇主要來源于卵泡、黃體、和胎盤，妊娠后母體和胎兒血液中的脫氫異雄酮（dehydroisoandrosterone，DHA）在胎盤組織內(nèi)轉(zhuǎn)化為E2和雌酮（E1）。男性雌二醇則主要來源于睪丸。在循環(huán)系統(tǒng)中的E2主要結(jié)合在性激素結(jié)合蛋白（sex hormone binding protein，SHBG）上，并在肝臟中代謝成水溶性硫酸脂和葡萄糖醛脂，再經(jīng)腎臟從尿液中排出體外。血清E2濃度是檢查下丘腦-垂體-生殖腺軸功能的重要指標，對輔助檢測某些內(nèi)分泌及婦科疾病具有一定的臨床價值。目前用免疫學檢測雌二醇的主流方法包括放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、化學發(fā)光法等，反應原理也有直接法與間接法兩類。本工作是利用抗-FITC與FITC標記抗體形成橋接模式，以微孔板為載體，采取直接競爭一步法，構(gòu)建了化學發(fā)光檢測雌二醇的免疫檢測方法，性能分析評估以及臨床評價的結(jié)果都比較滿意。

材料與方法

1 主要試劑與儀器

雌二醇單克隆抗體（Anti-E2Mab）與雌二醇-牛血清白蛋白（E2-BSA）購自Biospacific，辣根過氧化物酶（HRP）貨號P8375、雌二醇（E2）貨號E8875、異硫氰酸熒光素（FITC）貨號F7250購自Sigma-Aldrich，白色不透明化學發(fā)光板購自ThermoFisher Scientific，新生牛血清、牛血清白蛋白（BSA）均購自蘭州民海生物工程有限公司，其它化學試劑為國產(chǎn)分析純，血清樣本由北京中同藍博臨床檢驗所提供?；瘜W發(fā)光儀200S為廈門天中達生物科技有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 FITC偶聯(lián)BSA與E2Mab 參考李錚［1］的方法并略作改變，F(xiàn)ITC溶于二甲基甲酰胺（DMF）中，逐滴加入用碳酸緩沖液配制的蛋白溶液中，磁力攪拌反應4h，G25分離收集蛋白峰。分光光度計掃描，通過A495／A280計算偶聯(lián)比，最終用于免疫的FITC-BSA偶聯(lián)比為6∶1（F／P），用于免疫分析的FITC-E2Mab的偶聯(lián)比為3∶1（F／P）。

2.2 兔抗FITC抗體的制備 FITC-BSA用弗氏完全佐劑混合乳化后，多點注射免疫新西蘭兔，2周一次，共5次，ELISA測定抗體效價約為1∶10萬。辛酸-硫酸銨法進行多克隆抗體純化，0.02M PBS透析，-15℃以下保存。

2.3 辣根過氧物酶標記E2-BSA的制備 改良過碘酸鈉法，HRP中滴加NaIO4進行活化，加入E2-BSA于堿性條件下反應，NaBH4中止反應，透析后加入等體積甘油，在-15℃以下保存。E2-BSA與HRP的質(zhì)量比為1∶2。

2.4 預包被板的制備 將兔抗FITC抗體用0.02mol／L PB（pH7.4）稀釋至5μg／mL，100μL／孔，4℃放置過夜，棄去包被液。將FITC-E2Mab用0.02mol／L PB（pH7.4）、1% BSA、10%蔗糖溶液稀釋至不同工作濃度，100μL／孔，4℃放置過夜，棄去液體，拍干，在濕度低于30%條件下自然晾干。

2.5 校準品的制備 將雌二醇純品用乙醇溶解為10μg／mL，再用100%去激素血清稀釋為50、200、500、1000、3000pg／mL，作為校準品。標識為S1～S5，S0為100%去激素血清。

2.6 免疫分析程序 每孔加50μL校準品或樣本、酶結(jié)合物50μL于預包被板，37℃孵育1h。用洗滌液洗板5次，加1∶1預先混合發(fā)光底物100μL，室溫避光5min，測定發(fā)光值（RLU）。采用logit-ln模型進行直線擬合。方程為：log（Y）＝Alog（X）+B，Y為百分結(jié)合率，由Y＝（Bi／B0）／（1-Bi／B0）計算而得。

結(jié) 果

1 工藝的優(yōu)化

1.1 E2特異性抗體（FITC-抗-E2）的預包被濃度、酶結(jié)合物稀釋比例的選擇

參考賀敏［2］的免疫試劑濃度選擇的方法。當兔抗-FITC抗體（二抗）的包被濃度為5μg／mL時，選取FITC-抗-E2（一抗）的預包被濃度和HRP-E2-BSA稀釋比例為考察因素，每個因素擬定3個水平，進行交叉實驗。分別考察校準曲線的線性和空白檢測限，結(jié)果如表1所示，各因素各水平的均值如表2所示?？疾炀€性時，A因素（一抗預包被濃度）的K2值最大，B因素（酶結(jié)合物稀釋比例）的K2值最大；考察最低檢出限時A因素的K1最小，B因素的K2最小。A2B2組合線性最優(yōu)且最低檢出限與A1B2相差不大。綜合二者考慮，免疫試劑最佳工作濃度為一抗的預包被濃度為20 ng／mL，酶稀釋比例為1∶20000。按以上條件，校準曲線︱R︱為0.9990，空白檢測限為4.8pg／mL。

表1 免疫試劑濃度的選擇

表2 各因素水平的均值比較

1.2 酶結(jié)合物緩沖體系的選擇

用0.02mol／LPBS（pH7.4）分別配制含20%小牛血清稀釋液（A）和含1% BSA稀釋液（B）。用以上兩種稀釋液分別配制工作濃度的酶結(jié)合物。分別考察與二抗板（只進行了二抗的包被，未進行E2特異性抗體的包被）的非特異性結(jié)合，以及37℃7天的加速熱穩(wěn)定性?？疾旆翘禺惤Y(jié)合時，A、B稀釋液的非特異性結(jié)合率（使用二抗板時的S0的光子數(shù)與一抗預包被板S0光子數(shù)的比值）均小于0.01%，表現(xiàn)均較好。將兩種稀釋液配制的酶結(jié)合物置于37℃7天后，分別與4℃保存的試劑進行對比實驗。計算37℃試劑與4℃試劑實驗的各校準品點RLU偏差百分比，結(jié)果如表3所示，A稀釋液的穩(wěn)定性好于B。

表3 兩種稀釋液熱穩(wěn)定性對比

2 反應時間選擇

本分析采用一步法，對比分析20、40、60、100、120min對發(fā)光值的影響。由圖1可以看出37℃孵育60min，反應即可達到平衡。

圖1 反應時間的選擇

3 性能指標評價

3.1 校準品曲線及空白檢測限

同時測定20孔S0，計算RLU的均值x，和標準差s，以為Y值，代入校準品曲線公式，計算出相對應的的濃度值為4.8 pg／mL，即為本方法的空白檢測限。

3.2 定量檢測限

將濃度為50pg／mL的校準品用去激素血清依次稀釋為40、30、20、10、5pg／mL，分別進行10孔重復測試，TE%＝｜相對偏倚｜+1.96CV%，各濃度的TE%分別為12%、21%、35%、46%、52%。以TE%不超過30%為定量檢測限，定量檢測限為30pg／mL。

3.3 線性

將一份已知濃度為3032ng／mL的雌二醇高值樣本用校準品稀釋液倍比稀釋，其中最大稀釋比例為1／100，濃度約30.32。樣本稀釋曲線如圖2所示，E2樣本的稀釋度與本方法測定值得相關(guān)方程Y＝3069X，r＝0.9982，表明在本方法在30～3000 pg／mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

3.4 回收率

將濃度為1900pg／mL的雌二醇樣品（A）分別加入到41pg／mL、462pg／mL的血清樣本（B）中，加入比例為1：9，測定值分別為213pg／mL、604pg／mL。根據(jù)公式R＝［C×（V0+V）-C0×V0］／（V×CS）×100%計算回收率分別為92.7%、99.1%，平均回收率為95.9%。（式中：R—回收率；V—樣品A液的體積；V0—樣品B液的體積；C—樣品B液加入A液后的檢測濃度；C0—樣品B液的濃度；CS—樣品A液的濃度。

3.5 分析特異性

配 制100ng／mL雌 三 醇、100ng／mL孕 酮、100ng／mL睪酮，測定結(jié)果為0.10ng／mL、0.07ng／mL和0.03ng／mL，交叉反應率分別為0.1%、0.07%、0.03%。根據(jù)人血清內(nèi)甾體激素的含量，雌三醇、孕酮、睪酮濃度的變化，不影響雌二醇測定結(jié)果的分析。

3.6 分析內(nèi)精密性與批間精密性

取低中高3份樣本，在1次實驗中平行測定10孔，計算分析內(nèi)精密度；用3批試劑重復分析內(nèi)精密度實驗，用30孔的測量結(jié)果計算批間精密性。結(jié)果如表4、表5所示。分析內(nèi)平均變異系數(shù)為5.6%，分析間平均變異系數(shù)為8.7%。

表5 分析間精密度（n＝30，pg／mL）

3.7 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

使用37℃保存7天、4℃保存12個月的試劑盒、新制備試劑盒，同時進行測試10份濃度不同樣本，結(jié)果如表6所示，穩(wěn)定性試驗的試劑計數(shù)均有下降，相關(guān)系數(shù)及測值偏差可以接受，使用配對t檢驗，P均＞0.05，表示測值差異無統(tǒng)計學意義。

表6 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

3.8 臨床比對結(jié)果

使用雌二醇全自動化學發(fā)光試劑（Beckman Coulter，Inc.）與本方法同時測定164份樣本的雌二醇濃度，二者相關(guān)性如圖3，相關(guān)性方程為Y＝0.862 X+26.084，r＝0.979。

圖3 兩種試劑盒樣本測定結(jié)果的相關(guān)性

根據(jù)相關(guān)性方程計算本方法與貝克曼在不同濃度的測值相對偏倚，結(jié)果見表7。

表7 本方法與貝克曼試劑測值的相對偏倚

本方法與貝克曼試劑測定結(jié)果用EXCEL進行配對t檢驗，t＝0.01，P＞0.05，兩者差異無統(tǒng)計學意義。

討 論

小分子的檢測是臨床免疫檢驗的一個難點，除了高親和力的抗體、合適位點的人工抗原［3］外，其反應模式的設計也非常耗費精力。小分子的基本反應模式可分為直接競爭法與間接競爭法［4］，直接競爭法是用辣根過氧化物酶標記抗原［5-6］，間接競爭法則是將人工抗原固定于固相載體［7-8］。一般而言直接競爭法反應更迅速，但兩種方法的靈敏度高低則沒有固定的規(guī)律。在兩種基本的競爭模型上，還可以應用二抗、熒光素、生物素等構(gòu)成多級聯(lián)動反應，以獲得更好的效果。

異硫氰酸熒光素（FITC）-抗-FITC在免疫檢測中有不少成功的應用［9］。陳茶［10］等應用抗-FITC包被固相，F(xiàn)ITC標記抗原，建立非均衡競爭雌二醇化學發(fā)光法。本文利用FITC進行二次包被抗體，可以有效減少空間位阻，通過兩層包被，特異性抗體遠離固相載體，其與小分子抗原、酶標記抗原的反應受到微孔板的干擾小，結(jié)合速率更快，對小分子與酶標記抗原的識別更趨向一致，從而檢測效果更好。此外還可以提高E2單克隆抗體的包被效率。一般物理包被單克隆抗體的利用率在30%左右，而每個IgG分子有86個賴氨酸殘基，可以結(jié)合多個FITC分子，再通過免疫反應連接到抗-FITC上，單抗利用率在80%左右，有效節(jié)約成本。

本方法構(gòu)建的試劑盒，檢測范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，空白檢測限4.8pg／mL，定量檢測限30 pg／mL，與雌三醇、睪酮、孕酮均無明顯交叉反應，與進口全自動化學發(fā)光試劑同時測定164份樣本，二者測定結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.979。反應僅需1小時，能夠滿足批量快速檢測的市場需求，在臨床檢驗工作中具有一定的應用價值。