青蒿琥酯對結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6表達(dá)的影響

馬小華，劉愛鳳，向延根，劉棟賓，潘建華，喻 容，石國民

（長沙市中心醫(yī)院，1.檢驗(yàn)科，2.病理科，湖南 長沙410004）

結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，Mtb）是引起結(jié)核病的重要病原菌，是傳染性疾病的重要病原體之一［1-2］。Mtb侵入機(jī)體，僅有5%～15%的機(jī)會(huì)發(fā)展成活動(dòng)性肺結(jié)核［3］?？梢?，機(jī)體的自我免疫調(diào)節(jié)對Mtb感染的控制起到至關(guān)重要的作用。Mtb誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生某些前炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子，前者可使炎癥反應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大，進(jìn)一步加重機(jī)體損傷［4］。因此，尋求有效的抗炎制劑，適當(dāng)?shù)囊种七^度的炎癥反應(yīng)有利于維護(hù)機(jī)體處于穩(wěn)態(tài)。青蒿琥酯（artesunate，ASN）是從菊科植物黃花蒿中分離出的一種能治療瘧疾、具有過氧橋的倍半萜內(nèi)酯類化合物，為青蒿素的衍生物。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯對結(jié)核分枝桿菌具有一定的抑制作用［5］。然而其在機(jī)體內(nèi)如何調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)尚未清楚。本研究旨在研究ASN對Mtb引起的TNF-α、IL-6表達(dá)的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。

材料和方法

1 主要試劑和耗材

Mtb臨床分離株由本室保存，H37Rv由中國疾病控制中心結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供，均經(jīng)100℃30min滅活；THP-1細(xì)胞株購于ATCC，由本院中心實(shí)驗(yàn)室保存；TNF-α、IL-6試劑盒購于北京四正柏有限公司；所有引物購于金斯瑞公司；超純RNA提取試劑盒為康為世紀(jì)產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑和SYBR green熒光定量qPCR Mix試劑為GeneCopoeia產(chǎn)品；RPMI1640培養(yǎng)基為Hyclone產(chǎn)品；6、12、96孔板為Corning產(chǎn)品；所有的離心管、槍吸頭、八連管等為Axygen產(chǎn)品，均為無熱源無內(nèi)毒素耗材。

2 MTT法檢測ASN對細(xì)胞毒性影響

MTT法簡要操作如下：體外培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長至融合度約為80%時(shí)，換液，用不含血清RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104／mL，取100μL接種于96孔板，加入0～20μg／mL ASN培養(yǎng)12～48 h，然后每孔加入MTT試劑20μL，放置37℃，5%CO2孵育4h，去掉培養(yǎng)基，每孔加入100μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），混勻，放置波長為570nm處測量吸光度值。

3 Real-time qPCR檢 測TNF-α、IL-6、TLR2mRNA表達(dá)

細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)分組處理完畢后，分別收集24h THP-1細(xì)胞，用Trizol試劑盒提取總RNA，引物信息如下：TNF-α上游引物：5′-GCCCAGGCAGTCAGATC ATC-3′，TNF-α下游引物：5′-CGGTTCAGCCACTGGA GCT-3′；IL-6上游引物：5′-TTCGGTCCAGTTGCCTTC TC-3′，IL-6下游引物：5′-GAGGTGAGTGGCTGTCTG TG-3′；TLR2上 游 引 物：5′-CTGCAAGCTGCGGAAG ATAAT-3′，TLR2下游引物：5′-AGGACTTTATCGCAG CTCTCAGA-3′；GADPH上游引物：5′-ACCAGCCTCA AGATCATCAGC A-3′，GADPH下 游 引 物：5′-TGCTAAGCAGTTGGTGGTGC-3′。將提取的總RNA按操作說明做逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行real-time qPCR。擴(kuò)增程序如下：95℃10min，然后進(jìn)行95℃15s，60℃20s，72℃31s共40個(gè)循環(huán)。所得結(jié)果采用2-ΔΔCT方法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。

4 ELISA檢測ASN對Mtb誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6分泌影響

按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將細(xì)胞分組處理完畢，分別于24 h收集細(xì)胞，將細(xì)胞通過2個(gè)凍融循環(huán)（先置-80℃15min，再置37℃15min）充分裂解細(xì)胞，將裂解產(chǎn)物置入EP管，1000r／min離心5min，所得上清即為待測樣本。按試劑說明行ELISA檢測TNF-α、IL-6含量。

5 Western blot檢測TLR2受體表達(dá)

用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)／mL，接種至6孔板，將細(xì)胞分組處理完畢，分別于24h收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS漂洗3次，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞后，4℃12000r／min離心10min。取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將等量的蛋白上樣于12%SDS-PAGE上電泳，轉(zhuǎn)膜，隨后置于5%的無脂奶粉中封閉1h，加入不同稀釋度的一抗（TLR2：1∶500；β-actin：1∶1000）于4℃孵育過夜，PBST清洗3遍，加入1∶5000二抗，37℃孵育1 h，ECL試劑顯影。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 青蒿琥酯對細(xì)胞毒性研究

為了研究青蒿琥酯（ASN）對THP-1細(xì)胞的活性的影響，本研究采用0～20μg／mL的ASN對THP-1細(xì)胞進(jìn)行處理，MTT法檢測THP-1細(xì)胞活性。圖1顯示，上述ASN濃度下THP-1細(xì)胞活性均大于90%以上，說明上述濃度ASN對THP-1細(xì)胞活性并不產(chǎn)生毒性，可用于后續(xù)研究。

圖1 ASN對細(xì)胞毒性影響

2 青蒿琥酯對Mtb誘導(dǎo)的TNF-α表達(dá)影響

Mtb誘導(dǎo)的TNF-α過量表達(dá)能進(jìn)一步加重組織損傷，為了研究ASN能否減弱Mtb誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，本研究采用5～20μg／mL ASN預(yù)處理THP-1細(xì)胞4h，隨后加入Mtb（MOI為10∶1）進(jìn)行刺激THP-1細(xì)胞24 h，RT-qPCR檢測TNF-αmRNA表達(dá)，ELISA測定TNF-α蛋白分泌。圖2結(jié)果顯示，ASN能濃度依賴性地抑制TNF-αmRNA和蛋白表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 ASN對Mtb誘導(dǎo)的TNF-α表達(dá)影響

3 青蒿琥酯對Mtb誘導(dǎo)的IL-6表達(dá)影響

為了研究ASN能否減弱Mtb誘導(dǎo)的IL-6表達(dá)，本研究采用20μg／mL ASN預(yù)處理THP-1細(xì)胞4 h，隨后加入Mtb（MOI為10∶1）進(jìn)行刺激THP-1細(xì)胞24 h，RT-qPCR、ELISA分別檢測IL-6 mRNA和蛋白分泌。圖3結(jié)果顯示，ASN能抑制IL-6 mRNA和蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 ASN對Mtb誘導(dǎo)的IL-6表達(dá)影響

4 青蒿琥酯對Mtb誘導(dǎo)的TLR2表達(dá)影響

為了研究ASN能否減弱Mtb誘導(dǎo)的TLR2受體表達(dá)，本研究采用20μg／mL ASN預(yù)處理THP-1細(xì)胞4h，隨后加入Mtb（MOI為10：1）進(jìn)行刺激THP-1細(xì)胞24h，RT-qPCR、Western blot分別檢 測TLR2 mRNA及蛋白表達(dá)。圖4結(jié)果顯示，ASN能抑制TLR2 mRNA和蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 ASN對Mtb誘導(dǎo)的TLR2表達(dá)影響

討 論

結(jié)核病是危害人類健康的主要傳染病之一。據(jù)2017年WHO報(bào)告的全球結(jié)核病現(xiàn)狀顯示，2016年全球新發(fā)結(jié)核病為1040萬人，其中MDR-TB和RRTB新發(fā)病例數(shù)達(dá)60萬［6］。由于抗結(jié)核新藥的匱乏，給這些新發(fā)病的耐藥患者的治療帶來了困擾，包括治療效果差，不良反應(yīng)大，治愈率低。因此，尋找有效的抗結(jié)核新藥迫在眉睫。青蒿琥酯是從菊科植物黃花蒿中分離出的一種能治療瘧疾、具有過氧橋的倍半萜內(nèi)酯類化合物，為青蒿素的衍生物。我們前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)青蒿琥脂能有效地逆轉(zhuǎn)MTB對抗結(jié)核藥物的耐藥性［7］。本研究中，我們探討了ASN對MTB誘導(dǎo)的炎癥的影響并探討可能機(jī)制。結(jié)果顯示，ASN能顯著降低MTB誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6分泌（P＜0.05），可能與ASN降低TLR2受體表達(dá)有關(guān)。

當(dāng)機(jī)體受到MTB感染后，TNF-α是出現(xiàn)時(shí)間最早的促炎細(xì)胞因子，表達(dá)變化最明顯。TNF-α能激活中性粒細(xì)胞，促使中性粒細(xì)胞粘附于細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而游離出血管進(jìn)入炎癥部位，大量的中性粒細(xì)胞聚集并激活可導(dǎo)致氧自由基和蛋白水解酶等釋放，同時(shí)能刺激單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞釋放IL-6、IL-1β和其本身釋放，機(jī)體在清除病原體的過程中也會(huì)引起嚴(yán)重的組織損傷甚至休克，加重肺組織損傷［8］。因此，在MTB引起的持續(xù)性感染的過程中，有必要抑制過量的細(xì)胞因子的分泌以緩解由其引起的過度的炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)ASN顯著抑制TNF-α、IL-6mRNA及蛋白分泌，說明ASN可能具有緩解Mtb引起的炎癥反應(yīng)作用。

TLRs受體是一種具有保守結(jié)構(gòu)的單個(gè)跨膜非催化蛋白分子，表達(dá)于免疫細(xì)胞表面重要的PRRs，是連接天然免疫和特異性免疫的橋梁［9-10］。目前發(fā)現(xiàn)并命名的TLRs受體中有11種表達(dá)于人類。TLRs是免疫細(xì)胞抵抗病原菌感染的重要受體［11］。在感染期間，TLRs與病原體配體結(jié)合，隨后通過MyD88依賴性途徑或非依賴性途徑介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌［12］。文獻(xiàn)報(bào)道TLR2和NOD2能介導(dǎo)金黃色葡萄球菌感染釋放細(xì)胞因子，而ASN能通過抑制TLR2和NOD2表達(dá)進(jìn)而減少細(xì)胞因子分泌［13］。李斌等［14］報(bào)道ASN能抑制LPS或熱休克大腸埃希菌等誘導(dǎo)的TLR4mRNA的表達(dá)，進(jìn)而抑制前炎細(xì)胞因子產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)ASN能夠抑制Mtb誘導(dǎo)的TLR2mRNA和蛋白表達(dá)。推測ASN可能通過抑制TLR2受體而抑制TNF-α和IL-6的分泌。

綜上所述，ASN能夠抑制Mtb誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6分泌，并且能夠抑制Mtb誘導(dǎo)的TLR2 mRNA和蛋白表達(dá)。因此，在Mtb引起的持續(xù)性感染的過程中，ASN可能具有緩解Mtb誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)作用，可能成為一種潛在的抗結(jié)核的免疫制劑。