ALDH2在白藜蘆醇改善大鼠慢性酒精性肝損傷中的機制＊

黃丙清，邱 香，王林枝，朱騰世，郭琰芳，郝麗萍

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，武漢 430030

ALDH2在白藜蘆醇改善大鼠慢性酒精性肝損傷中的機制＊

黃丙清，邱 香，王林枝，朱騰世，郭琰芳，郝麗萍△

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，武漢 430030

目的 探討酒精代謝酶乙醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶2（ALDH2）在白藜蘆醇（resveratrol，Res）改善大鼠慢性酒精性肝損傷中的機制。方法 采用含酒精的Lieber－DeCarli液體飼料喂養(yǎng)大鼠19周，建立慢性酒精性肝損傷模型。42只SD大鼠隨機分成正常對照組，低、中、高劑量酒精組，Res對照組，高劑量酒精＋Res組。采用蘇木精－伊紅（HE）和油紅O染色，觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變；采用試劑盒測定肝組織中ADH、ALDH2的活性；Western blot檢測肝組織中ADH與ALDH2的蛋白表達。結(jié)果 各劑量酒精組大鼠肝組織脂肪變性和炎癥浸潤明顯，體重和能量攝入量與正常對照組相比下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；且肝組織ADH活性與蛋白表達略有升高，而肝組織ALDH2活性與蛋白表達顯著下降。Res干預(yù)后大鼠肝組織脂肪變性和炎癥浸潤均較高劑量酒精組顯著減輕，體重與能量攝入量增加，顯著提升了肝組織中ALDH2的活性與蛋白表達（P＜0.05）。結(jié)論 Res可能通過對大鼠肝臟ALDH2的調(diào)節(jié)來改善慢性酒精攝入引起的肝臟損傷。

酒精性肝損傷； 白藜蘆醇； 乙醇脫氫酶； 乙醛脫氫酶2

酒精是全世界最常被濫用的物質(zhì)之一，長期的慢性酒精攝入會導(dǎo)致酒精性肝損傷。酒精性肝損傷的發(fā)病機制比較復(fù)雜，酒精在肝臟內(nèi)代謝產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物及其引起的代謝紊亂是導(dǎo)致酒精性肝損傷的重要原因之一［1］。調(diào)節(jié)酒精代謝酶的變化，對減少酒精在肝臟內(nèi)代謝產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物及其引起的代謝紊亂都起著重要作用［2］。白藜蘆醇（Resveratrol，Res）是中藥虎杖的主要成分之一，具有抗癌、抗心血管疾病、抗突變、抗菌、抗炎、抗氧化、誘導(dǎo)細胞凋亡及雌激素調(diào)節(jié)等多方面有益人類健康的生物藥理活性［34］。有研究報道Res對過氧化氫、四氯化碳、酒精等所致的肝損傷有保護作用［57］，但具體涉及的保護機制各不相同，并且有關(guān)Res對慢性酒精攝入誘發(fā)酒精性肝損傷過程中酒精代謝酶的變化鮮有報道。故本研究采用含酒精的Lieber－DeCarli液體飼料喂養(yǎng)大鼠建立慢性酒精性肝損傷模型，同時給予Res干預(yù)，研究Res對大鼠酒精性肝損傷的保護作用以及對酒精代謝酶乙醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶2（ALDH2）的影響，為進一步探討Res防治酒精性肝損傷的作用機制提供實驗資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

白藜蘆醇（Res，純度98%，南京澤朗生物有限公司）；95%食用酒精（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙醇脫氫酶（ADH）活性檢測試劑盒以及考馬斯亮藍蛋白測試盒（南京建成生物公司）；乙醛脫氫酶（ALDH2）活性檢測試劑盒（美國Bio－Vision公司）；ADH抗體、ALDH2抗體和β－actin抗體（美國Abcam公司）；辣根過氧化物標記的抗兔／鼠二抗（美國CST公司）；多功能酶標儀（美國Bio－Tek公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；5804－R低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）；蛋白成像分析系統(tǒng)（英國Syngene公司）。

1.2 動物模型建立與分組

1.2.1 實驗動物 雄性Sprague－Dawley大鼠42只，體重（180±10）g，購于上海西普爾－必凱實驗動物有限公司。大鼠飼養(yǎng)于室溫（22±2）℃；濕度50%～70%的環(huán)境中。

1.2.2 飼料配方 基礎(chǔ)飼料由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供；Lieber－DeCarli液體飼料購自北京華阜康生物科技有限公司，液體分為:不含酒精的對照組液體飼料和含酒精的模型組液體飼料，具體成分見表1。

1.2.3 動物分組及處理 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，前3d給予普通的基礎(chǔ)飼料，后4d給予不含酒精的對照組液體飼料，待大鼠適應(yīng)了這種液體飼料后，按體重隨機分成6組，即:正常對照組，低、中、高酒精劑量組（0.8、1.6、2.4g／kg），Res對照組，高劑量酒精＋Res組，每組7只。根據(jù)前期預(yù)實驗，定量給予每只大鼠每天100mL液體飼料。正常對照組，喂飼不含酒精的對照組液體飼料；酒精組，喂飼不同酒精劑量的模型組液體飼料，其添加酒精體積根據(jù)大鼠的體重換算出，并添加相應(yīng)的麥芽糊精以達到與正常對照組總供能一致，均提供1kcal／mL的能量，具體方法見表1；Res對照組，喂飼對照組液體飼料＋100mg／（kg·d）Res；高劑量酒精＋Res組，喂飼模型組液體飼料（高劑量）＋100mg／（kg·d）Res。白藜蘆醇與酒精劑量的選擇依據(jù)我們先前的報道。液體飼料每天新鮮配置，白藜蘆醇加入液體飼料混勻。每天記錄進食量、每周記錄體重，喂養(yǎng)19周后處死所有動物，分離并留取肝臟，做病理切片及相關(guān)指標檢測。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 肝臟蘇木精－伊紅（HE）與油紅O染色 大鼠解剖分離肝臟后，于肝臟左葉最大邊緣5mm處取1cm×0.5cm×0.5cm肝臟組織5塊，其中1塊以4%的多聚甲醛溶液固定，包埋、切片，進行HE染色；1塊以無菌濾紙吸凈肝臟表面水分和血液后快速冷凍于液氮中用于油紅O染色；剩下的3塊快速冷凍于液氮中，－80℃冰箱儲存?zhèn)溆?。每組隨機選取3只用于HE染色，7只都做油紅O檢測。肝臟的病理評分根據(jù)肝臟病理切片肝細胞受損程度:脂質(zhì)評分（1分，1%～；2分，25%～；3分，50%～；4分，75%～），炎性評分（0分，沒有；1分，輕度；2分，中度；3分，重度）［8］。

表1 Lieber－DeCarli飼料配方成分表（100mL）Table1 Ingredient list of Lieber－DeCarli formula（100mL）

1.3.2 肝臟ADH與ALDH2活性檢測 ADH活性測定根據(jù)ADH催化氧化型輔酶Ⅰ反應(yīng)的原理，通過測定340nm處吸光度的變化率得出其酶活性。ALDH2測定根據(jù)醇脫氫酶、輔酶NAD＋和底物在一定溫度和pH的條件下反應(yīng)，通過每分鐘波長340nm處吸光度值的變化，計算每分鐘NAD＋轉(zhuǎn)化為NADH的量，從而得到該酶的酶活性。ADH與ALDH2活性檢測按照酶比色法及相應(yīng)的試劑盒說明書進行。

1.3.3 Western blot測定ADH與ALDH2的蛋白表達 RIPA法提取肝臟蛋白，改良Lowry’s法測定且調(diào)整蛋白濃度后，取45μg蛋白，經(jīng)10%SDSPAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBST洗膜，置5%脫脂牛奶封閉2h，將膜置于ADH與ALDH2的一抗后4℃過夜，洗滌后將膜置于相應(yīng)的二抗后孵育1h，洗膜后加ECL發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)中成像，并對相應(yīng)的條帶進行半定量分析，算出目的蛋白條帶與相應(yīng)的內(nèi)參比值后與正常對照組相比作為相對蛋白表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有的數(shù)據(jù)錄入Microsoft Excel 2007，進行數(shù)據(jù)處理后，用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以ˉx±s表示。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義時采用最小顯著法（LSD法，方差齊）或Dunnett T3法，方差不齊）進行組間兩兩比較。非參數(shù)秩和檢驗用于肝臟病理切片評分比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的體重與進食量的變化

慢性酒精攝入后，各酒精劑量組大鼠體重、總能量攝入量明顯低于正常對照組（P＜0.05或P＜0.01）。白藜蘆醇干預(yù)后，與酒精高劑量組相比，大鼠體重得到了提高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），總能量攝入有所提高，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 大鼠體重與能量攝入量的變化（s，n＝7）Table2 Changes of body weight and energy intake of ratss，n＝7）

表2 大鼠體重與能量攝入量的變化（s，n＝7）Table2 Changes of body weight and energy intake of ratss，n＝7）

與正常對照組比較，＊P＜0.05＊＊P＜0.01；與酒精高劑量組比較，△P＜0.05

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2.2 大鼠肝臟組織的病理變化

從圖1A中可以看出光鏡下HE染色顯示:正常對照組的肝細胞排列緊密，細胞核位于細胞中央，核大而圓，酒精模型組的肝細胞排列疏松，肝細胞中出現(xiàn)了很大的脂肪空泡（圖1A中箭頭所示），也有很多彌漫性的小脂滴聚集。Res干預(yù)后，與酒精高劑量組相比細胞形態(tài)得到了改善，很少出現(xiàn)大脂肪空泡，細胞形態(tài)也趨于正常。從圖1B油紅O染色中可以看出，酒精組大鼠肝細胞出現(xiàn)很多紅色脂滴，且呈劑量依賴性增加，Res干預(yù)后得到了顯著性改善。表3給出了各組大鼠肝臟病理切片的脂質(zhì)評分與炎性評分，低、中、高酒精劑量組切片的脂質(zhì)評分與中、高酒精劑量組炎性評分顯著高于正常對照組（P＜0.05或P＜0.01），Res干預(yù)后肝臟的脂質(zhì)評分與酒精高劑量組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 大鼠肝臟的脂質(zhì)評分與炎性評分（平均秩次）Table3 Scoring of hepatic steatosis and inflammation in rats（mean rank）

2.3 大鼠肝臟組織中ADH與ALDH2酶活性與蛋白的表達

慢性酒精攝入后升高了ADH的活性與蛋白的表達，但與正常對照組相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；Res干預(yù)后，與酒精高劑量組比較略有降低（P＞0.05）。與正常對照組相比，中、高劑量酒精攝入降低肝臟ALDH2酶活性與蛋白表達（P＜0.01或P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性；Res干預(yù)后，與酒精高劑量組相比ALDH2酶的活性與蛋白表達得到了升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4，圖2。

圖1 各組大鼠肝臟組織HE染色和油紅O染色切片圖Fig.1 HE－（upper，×400）and Oil red O－（bottom，×400）stained liver sections from different rat groups

表4 大鼠肝臟組織中ADH與ALDH2酶的活性與蛋白的相對表達（s）Table4 The activities and the relative protein expressions of ADH and ALDH2in liver tissues of rats（s）

表4 大鼠肝臟組織中ADH與ALDH2酶的活性與蛋白的相對表達（s）Table4 The activities and the relative protein expressions of ADH and ALDH2in liver tissues of rats（s）

與正常對照組比較，＊P＜0.05＊＊P＜0.01；與酒精高劑量組比較，△P＜0.05

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圖2 各組大鼠肝臟中ADH與ALDH2蛋白表達Fig.2 Representative pictures of protein expressions of hepatic ADH and ALDH2in each rat groups

3 討論

肝臟是酒精在體內(nèi)代謝的主要器官，也最容易受到酒精代謝產(chǎn)物毒性的侵害。酒精及其代謝產(chǎn)物造成肝細胞反復(fù)脂肪變性、壞死和再生，導(dǎo)致酒精性肝損傷的發(fā)生，進一步可發(fā)展為酒精性肝炎、纖維化以及酒精性肝硬化，最終發(fā)展為肝癌［910］。

本次研究表明了慢性酒精攝入能夠誘發(fā)大鼠機體毒性的產(chǎn)生與肝臟脂質(zhì)的聚集。從表2中可以看出慢性酒精攝入后各酒精劑量組的大鼠體重與總能量攝入量明顯低于正常對照組，從各組大鼠肝臟的病理切片可以看出各酒精劑量組出現(xiàn)大量脂肪空泡與脂滴（圖1）。此外，各酒精劑量組與正常對照組相比，肝臟的脂質(zhì)評分與炎性評分得到了顯著的提高，進一步揭示了慢性酒精攝入誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)聚集與損傷，這也與先前的報道一致［5］。

酒精在肝細胞內(nèi)首先主要通過ADH與微粒體細胞色素P450（CYP2E1）氧化成乙醛，后者主要在肝臟線粒體內(nèi)由ALDH2氧化成乙酸而降解［1112］。長期攝入酒精可以使肝臟線粒體功能紊亂［13］，氧化乙醛的能力大大下降，而乙醇的氧化速度不變甚至提高，造成乙醛生成與降解不平衡，導(dǎo)致肝內(nèi)乙醛含量增加。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，慢性酒精攝入后肝臟ADH的活性與蛋白的表達略有升高（均P＞0.05），但中、高酒精劑量組ALDH2的活性與蛋白表達顯著降低。由于ALDH2是肝臟內(nèi)清除乙醛的主要酶，因此升高的ADH表達伴隨著降低的ALDH2表達，揭示了肝臟乙醛的聚集。聚集的乙醛可以通過與半胱氨酸和谷胱甘肽結(jié)合使肝內(nèi)谷胱甘肽水平下降。肝臟內(nèi)谷胱甘肽的減少使其抗氧化能力下降，從而有利于其它因素所致的脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致肝臟損傷［14］。此外乙醛可促進肝星狀細胞活化，導(dǎo)致肝星狀細胞中的Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白基因表達增加，從而引起細胞外基質(zhì)在肝內(nèi)沉積，導(dǎo)致肝纖維化形成［1］。因此，上調(diào)ALDH2的表達，將會減少肝臟乙醛聚集，對改善酒精性肝損傷起著重要作用。

在本次研究中我們可以看出Res干預(yù)后增加了大鼠的體重和總能量攝入量，改善了各組大鼠肝臟的病理變化（降低了脂質(zhì)評分與炎性評分），體現(xiàn)了有效的肝臟保護作用，這與先前的部分報道一致［5，1516］。Res的肝臟保護機制已被證實與其強大的生物學(xué)活性有關(guān)，但具體的機制目前并不清楚。體外的細胞實驗發(fā)現(xiàn)Res能夠提升人外周血淋巴細胞ALDH2mRNA的表達，抑制ADH mRNA的表達，可預(yù)防酒精誘導(dǎo)的氧化DNA損傷［17］，提示我們Res具有在基因水平調(diào)節(jié)乙醇代謝酶活性的潛力。另一方面，我們的研究發(fā)現(xiàn)與高劑量酒精組相比，Res干預(yù)后對大鼠肝臟ADH活性與蛋白表達沒有影響，但顯著地升高了肝臟ALDH2活性（P＜0.05）與蛋白的表達（P＜0.05）。提升的肝臟ALDH2活性與蛋白表達，體現(xiàn)了Res具有在蛋白分子水平上調(diào)控乙醇代謝酶的潛力，而且高表達的肝臟ALDH2將促使肝臟酒精代謝過程中乙醛的排出，改善了乙醛聚集導(dǎo)致的肝損傷，進一步揭示了Res有效的肝臟保護作用。此外，升高的ALDH2表達可能也間接揭示出Res干預(yù)后改善了線粒體功能的紊亂，體現(xiàn)了良好的線粒體保護功能。綜上所述，Res對慢性酒精攝入誘導(dǎo)的大鼠酒精性肝損傷具有一定的保護作用，其作用機制可能與調(diào)節(jié)ALDH2的酶活性與蛋白的表達有關(guān)，但有關(guān)Res對ALDH2調(diào)節(jié)的具體機制需要進一步探討。

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（2013－12－13 收稿）

Resveratrol Protects against Chronic Alcoholic Liver Injury by Regulating Hepatic ALDH2 Expression in Rats

Huang Bingqing，Qiu Xiang，Wang Linzhi et al
Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Objective To evaluate the protective effects of resveratrol（Res）on chronic alcoholic liver injury in rats and further explore the underlying mechanism involving hepatic ethanol metabolizing enzymes（ADH and ALDH2）.Methods Alcoholic liver injury models of rat were established by feeding Lieber－DeCarli liquid ethanol diet for 19weeks.Forty－two SD rats were randomly divided into normal control group，low－，middle－and high－dose ethanol groups，Res control group and high－dose ethanol＋Res group.The morphological change of hepatic tissues was observed by hematoxylin－eosin（HE）and oil red O staining；the activity of hepatic ADH and ALDH2was determined by using appropriate kits；and the protein expressions of hepatic ADH and ALDH2were detected by Western blot.Results There were serious hepatic steatosis and inflammation in ethanol groups.Body weight and food intake were significantly decreased in the ethanol groups compared with the normal control group.There was moderate increase in the ADH activity and expression and significant decrease in ALDH2activity and expression in ethanol groups.Res could ameliorate ethanol－induced hepatic steatosis and inflammation as well as increase body weight and energy intake.Hepatic ALDH2activity and protein expression were significantly increased by Res treatment（P＜0.05）.Conclusion Res could improve chronic ethanol－induced liver injury by regulating hepatic ALDH2expression.

alcoholic liver injury； resveratrol； ADH； ALDH2

R575

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.007

＊國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81172657）

黃丙清，男，1989年生，醫(yī)學(xué)碩士，E－mail:244850018＠qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:haolp＠m(xù)ails.tjmu.edu.cn