TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌組織中的表達(dá)及意義

牛蕾 雷麗

[摘要] 目的 研究TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌組織中的表達(dá)，揭示其在乳腺癌中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 方法 應(yīng)用免疫組化SABC法檢測(cè)62例乳腺癌組織中TGFβ1與Smad2/3的表達(dá)情況，利用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析TGFβ1與Smad2/3的差異性及相關(guān)性。 結(jié)果 TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，陽性表達(dá)率依次為69.35%（43/62）和40.32%（25/62）。TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌組織中的表達(dá)與年齡無關(guān)，TGFβ1與Smad2/3在組織學(xué)分級(jí)、病理學(xué)分類、TNM分期方面差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.261，P<0.05）。 結(jié)論 乳腺癌的發(fā)生可能與TGFβ1及Smad2/3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)生異常，致使下游信號(hào)Smad2/3突變，增加瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用、抑制免疫系統(tǒng)、增加血管形成等機(jī)制促進(jìn)乳腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 乳腺癌；TGFβ1；Smad2/3；相關(guān)性

[中圖分類號(hào)] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）17-0011-03

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor beta，TGFβ）是一族能引起細(xì)胞產(chǎn)生表型變化、具有多種生物學(xué)功能的蛋白多肽，可調(diào)節(jié)多種正常細(xì)胞或瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)分化。目前研究[1，2]表明：TGFβ/Smads信號(hào)途徑不僅在細(xì)胞及生物體生長(zhǎng)和發(fā)育過程中起重要作用，而且與人體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)。TGFβ/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一旦發(fā)生異常就可引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[3]。所以探討TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌組織中的表達(dá)，有利于揭示其在乳腺癌中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取阜新市中心醫(yī)院2004～2014年間62例乳腺癌存檔標(biāo)本?；颊吣挲g27～78歲，平均49歲。組織學(xué)分級(jí)按照Elston等[4]提出的Bloom-Richardson分級(jí)（即Nottingham分級(jí)），對(duì)每例乳腺癌組織從腺管形成、核分裂數(shù)和癌細(xì)胞異型性3個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分，按所得總分進(jìn)行分級(jí)：3～5 分為Ⅰ級(jí)，6～7 分為Ⅱ級(jí)，8～9分為Ⅲ級(jí)，Ⅰ級(jí)14例，Ⅱ級(jí)25例，Ⅲ級(jí)23例。病理學(xué)分類方法參照WHO1981年制定的乳腺癌分類[5]：導(dǎo)管內(nèi)癌8例、浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌48例、浸潤(rùn)性小葉癌4例、浸潤(rùn)性特殊癌2例。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）關(guān)于TNM分期方法[6]進(jìn)行臨床分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期14例，Ⅲ期32例，Ⅳ期8例。

1.2 試劑及方法

1.2.1 主要試劑 鼠抗人TGFβ1多克隆抗體，鼠抗人Smad2/3多克隆抗體（美國(guó)，Santa Cruz），SABC免疫組化染色試劑盒，DAB顯色盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2.2 方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色SABC法觀察TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌中的表達(dá)分布情況。切片常規(guī)脫蠟至水，浸入枸櫞酸鹽緩沖液，然后微波加熱15 min，室溫冷卻后PBS沖洗3次；用3%H2O2室溫（10 min）滅活內(nèi)源性酶，PBS沖洗3次；濕盒內(nèi)滴加5%BSA封閉液，室溫（20 min）甩去多余液體，不洗；滴加稀釋度為1∶100的一抗，4℃過夜，PBS沖洗3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃下30 min，PBS沖洗3次；滴加試劑SABC，37℃下30 min，PBS沖洗4次（以上PBS濃度均為0.01 mol/L）；DAB顯色，室溫控制反應(yīng)，蒸餾水充分洗滌；蘇木素輕度復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。每次染色流程均設(shè)有對(duì)照作為染質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。陽性對(duì)照用Santa Cruz公司已證實(shí)的陽性TGFβ1與Smad2/3切片為對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，至少由2名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師獨(dú)立觀察切片。

1.2.3 結(jié)果判定 在200倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)視野，記數(shù)每個(gè)視野中腫瘤上皮細(xì)胞的染色情況，取平均值。TGFβ1與Smad2/3陽性著色位于細(xì)胞質(zhì)中呈彌漫或散在的棕黃色顆粒。根據(jù)瘤組織中陽性細(xì)胞的有無及數(shù)量，將其分為陰性（-）：未見陽性細(xì)胞；弱陽性（+）：陽性細(xì)胞少于10%；陽性（++）：陽性細(xì)胞11%～30%；強(qiáng)陽性（+++）：陽性細(xì)胞多于30%[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法分析TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌中陽性表達(dá)的差異性，Spearman相關(guān)分析TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌中陽性表達(dá)的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織TGFβ1與Smad2/3的表達(dá)情況

TGFβ1主要表達(dá)在細(xì)胞漿，呈棕褐色顆粒狀（封三圖1）。Smad2/3主要彌漫分布于細(xì)胞漿和細(xì)胞核，呈棕褐色顆粒狀（封三圖2）。表1 TGFβ1的陽性表達(dá)率為69.35%（43/62），Smad2/3的陽性表達(dá)率為40.32%（25/62）。TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌組織中的表達(dá)與年齡無關(guān)（P>0.05），TGFβ1與Smad2/3在組織學(xué)分級(jí)、病理學(xué)分類、TNM分期組中的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 乳腺癌中TGFβ1與Smad2/3之間的關(guān)系

TGFβ1與Smad2/3均陽性為21例（33.87%）；TGFβ1陽性/Smad2/3陰性者22例（35.48%）；Smad2/3陽性/TGFβ1陰性者4例（6.45%）；TGFβ1與Smad2/3均陰性為15例（14.19%）；TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌中的表達(dá)存在正相關(guān)（r=0.261，P<0.05），見表2。

3討論

乳腺癌的發(fā)生是由多種異常癌基因和抑癌基因共同作用的積累。癌基因的激活和抑癌基因的失活導(dǎo)致宿主代謝發(fā)生改變，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失常，從而導(dǎo)致細(xì)胞異常分裂誘導(dǎo)癌變，這是腫瘤發(fā)生的根本原因[8]。

TGFβ至少有6種異構(gòu)體形式，TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，有60%～80%的序列同源[9]。各種異構(gòu)體在許多生物反應(yīng)中表現(xiàn)出相似的作用，其中TGFβ1最為重要，是人體內(nèi)主要的存在形式，且具有抑制早期腫瘤發(fā)生和促進(jìn)晚期腫瘤遷移擴(kuò)散的作用[10，11]。Smad是Mad和Sma蛋白及其類似物的統(tǒng)稱，即Smad（Sma-Mad）族蛋白。迄今為止，在哺乳動(dòng)物已經(jīng)分離鑒定的Smad 蛋白共有9種，作為TGFβ家族受體激酶的直接底物，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8。Smad1、Smad5和Smad8主要通過BMP受體磷酸化，介導(dǎo)BMP反應(yīng)。Smad2和Smad3被TGFβ受體磷酸化，轉(zhuǎn)導(dǎo)TGFβ和活化素的信號(hào)。Smad4是通用型蛋白，參與Smad2和Smad3介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。Smad6和Smad7的功能是抑制受體激動(dòng)的Smads蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，Smad6和Smad7可以阻斷TGF-β介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，有研究發(fā)現(xiàn)Smad7較Smad6的抑制作用更為明顯[12]。

本研究證實(shí)：TGFβ1主要表達(dá)于細(xì)胞漿，Smad2/3主要彌漫分布于細(xì)胞漿和細(xì)胞核，這與Shen N等[13]研究一致，Smad2和Smad3作為TGFβ1的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，轉(zhuǎn)導(dǎo)TGFβ1的信號(hào)。TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌組織中的表達(dá)與年齡無關(guān)，這可能是不同年齡的乳腺癌中TGFβ1與Smad2/3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已經(jīng)發(fā)生異常，過表達(dá)的TGFβ1未能有效抑制腫瘤發(fā)生，致使下游信號(hào)Smad2/3突變，參與了促進(jìn)腫瘤發(fā)生和擴(kuò)散的作用。而在組織學(xué)分級(jí)、病理學(xué)分類、TNM分期中TGFβ1與Smad2/3陽性表達(dá)與陰性表達(dá)存在差異性，且TGFβ1與Smad2/3在乳腺癌中的表達(dá)存在正相關(guān)，說明在不同組織學(xué)分級(jí)、病理學(xué)分類、TNM分期狀態(tài)下，腫瘤的浸潤(rùn)程度及轉(zhuǎn)移程度變化可能是在TGFβ1與Smad2/3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下發(fā)生的，其機(jī)制可能為TGFβ1活化后與細(xì)胞膜表面Ⅱ型受體結(jié)合，同時(shí)激活TβRⅡ磷酸化激酶，TβRⅠ識(shí)別此復(fù)合物并與之結(jié)合，又被TβRⅡ磷酸化激酶磷酸化而激活，作用于胞質(zhì)內(nèi)下游分子，開啟信號(hào)的傳導(dǎo)，激活Smad2和Smad3，將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，并作為轉(zhuǎn)錄因子單獨(dú)或與其他DNA結(jié)合蛋白結(jié)合后激活靶基因，從而影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，增加瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用、抑制免疫系統(tǒng)、增加血管形成等機(jī)制來促進(jìn)乳腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，同時(shí)也說明了組織學(xué)分級(jí)、病理學(xué)分類、TNM分期狀態(tài)在臨床應(yīng)用的重要性和必要性[14]。TGFβ/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑過程中可能還伴發(fā)著其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的調(diào)節(jié)和其他細(xì)胞因子的參與，但目前學(xué)術(shù)界基本認(rèn)為其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生存在正性的聯(lián)系。有研究表明[15]，TGFβ1在多種腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，抑制腫瘤生長(zhǎng)，當(dāng)腫瘤細(xì)胞耐受TGFβ1介導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制作用后，表現(xiàn)為TGFβ/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常，致使下游信號(hào)Smads突變及癌基因突變。Massague等[16]認(rèn)為，TGFβ1通過上調(diào)或下調(diào)其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達(dá)水平，以一種自身反饋調(diào)控機(jī)制在其信號(hào)終止過程中發(fā)揮重要作用。信號(hào)被細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子從胞漿轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用后，TGFβ1信號(hào)需要減弱并終止，以求細(xì)胞對(duì)TGFβ1刺激反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間得到精確控制。

綜上所述，TGFβ/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是我們揭示腫瘤發(fā)生過程的一條非常重要線索，其中通用性Smad4在乳腺癌發(fā)生中與TGFβ1和Smad2/3之間的關(guān)系還有待我們進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2015-03-19）