膀胱腫瘤中受體酪氨酸激酶基因的表達(dá)及臨床意義

羅志剛 鄧剛

[摘要] 目的 研究受體酪氨酸激酶基因（RON和EphA2）在膀胱腫瘤中的表達(dá)及臨床意義。 方法 選取我院收集的膀胱腫瘤新鮮組織標(biāo)本112例，其中TCCB82例、IPB14例、PUNLMP16例，選取同期正常膀胱黏膜20例為對(duì)照組，測(cè)定各組標(biāo)本RON及EphA2相對(duì)基因表達(dá)水平并分析。 結(jié)果 RON和EphA2在TCCB、IPB、PUNLMP組織中相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組（P<0.05），隨TCCB病理分級(jí)的升高（即分化程度降低）、臨床分期升高，RON mRNA和EphA2 mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；RON mRNA和EphA2 mRNA表達(dá)水平與TCCB病理分級(jí)及臨床分期呈正相關(guān)性。 結(jié)論 RON及EphA2可高表達(dá)于膀胱腫瘤組織中，可能與TCCB的發(fā)生發(fā)展具有一定關(guān)系。

[關(guān)鍵詞] 受體酪氨酸激酶基因；膀胱腫瘤；基因表達(dá)

[中圖分類號(hào)] R737.14 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）17-0004-04

膀胱腫瘤是臨床上泌尿系統(tǒng)的常見(jiàn)病、多發(fā)病之一，在我國(guó)位居泌尿系腫瘤首位，約占惡性腫瘤的4%，近年來(lái)其發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)[1]。研究表明，約95%膀胱腫瘤組織來(lái)源為膀胱上皮，其中絕大部分為惡性，其中又以膀胱上皮移行細(xì)胞癌最為多見(jiàn)[2-4]。隨著分子醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與進(jìn)步，研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌的發(fā)生發(fā)展可能與一系列特定基因改變有關(guān)，如受體酪氨酸激酶基因。RON是一種酪氨酸激酶受體，屬M(fèi)ET原癌基因，可使細(xì)胞失去精密鏈接及極性，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)，促進(jìn)細(xì)胞分散、播散、遷移及浸潤(rùn)[5]。RON作為癌蛋白中的一種，在人體上皮性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了不可忽視的作用[6]。EphA2亦是一種酪氨酸激酶受體，可參與并調(diào)控人體細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、生存、遷移等生物學(xué)行為，如過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及惡變[4，7]。本文旨在研究RON、EphA2在膀胱腫瘤組織中的表達(dá)情況并分析比較，初步探討其可能的致癌機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般材料

選擇2011年1月～2014年1月間我院收集的膀胱腫瘤新鮮組織標(biāo)本112例，其中膀胱移行細(xì)胞癌（TCCB）82例、內(nèi)翻性乳頭狀瘤（IPB）14例、低度惡性潛能尿路上皮瘤（PUNLMP）16例，其中男59例、女53例，年齡32～78（56.38±4.08）歲，TCCB臨床分期：Ta～T1 25例、T2～T3 36例，T4 21例，病理分級(jí)：Ⅰ級(jí)35例、Ⅱ級(jí)21例、Ⅲ級(jí)26例，以上診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合WHO（世界衛(wèi)生組織）TCCB病理分級(jí)及UICC（國(guó)際抗癌聯(lián)盟）臨床分期標(biāo)準(zhǔn)[8]。選取同期因外傷導(dǎo)致膀胱破裂者并經(jīng)病理證實(shí)健康的正常膀胱黏膜20例為對(duì)照組，男12例、女8例，年齡18～68（35.47±3.19）歲。以上病例均為首次發(fā)現(xiàn)并診斷，未行放化療，且診斷均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)。

1.2 FA-RT-PCR方法

1.2.1 儀器與試劑 美國(guó)ABI公司系列產(chǎn)品：ABI7000 PCR儀、DU800紫外分光光度計(jì)；上海仕博公司H6-1微型電泳儀；Trizol RNA抽提試劑盒、MBI Fermentas公司逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成試劑盒。

1.2.2 方法 按RNA抽提試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒實(shí)驗(yàn)流程提取組織樣本RON mRNA和EphA2 mRNA并合成樣本相應(yīng)cDNA。

1.2.3 RON 引物由上海基康生物技術(shù)有限公司合成：5-GCTACATCAACTCCCACATCACC-3，下游引物為5-GGGGTCTCGGACCACATATTC-3，內(nèi)參照GAPDH上游引物為5-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3，下游引物為5-CTGGAAGATGGTGATG-GGATT-3。反應(yīng)體系如下：cDNA 2 μL、0.6 μmol/L上游引物0.2 μL、0.6 μmol/L下游引物0.2 μL、SYBR Green Ⅰ 10 μL、DEPC水7.6 μL，總反應(yīng)體積為20 μL。擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性10 min、95℃變性15 s、60℃退火0.5 min，40循環(huán)。每次試驗(yàn)均設(shè)置1個(gè)陽(yáng)性、陰性、空白對(duì)照。

1.2.4 EphA2 引物由上海生工合成：上游引物為5-CACTTACCGCAAGAAGGGAG-3，下游引物為5-CACCAGAAGCAGGACCACA-3，內(nèi)參照β-actin上游引物為5-GGGACCTGACTGACTACCTCA-3，下游引物為5-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3。反應(yīng)體系如下：cDNA 3 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、SYBR Green Ⅰ 10 μL、DEPC水5 μL，總反應(yīng)體積為20 μL。擴(kuò)增條件如下：94℃ 5 min、94℃ 15 s、54℃ 15 s，39次循環(huán)。每次試驗(yàn)均設(shè)置1個(gè)陽(yáng)性、陰性、空白對(duì)照。

1.3 RON及EphA2 mRNA表達(dá)相對(duì)定量分析

實(shí)驗(yàn)確定2-ΔCT方法適用性后，以對(duì)照組樣本為參照因子，行內(nèi)標(biāo)均一化處理，然后通過(guò)公式ΔCTRON=CtRON-CtGAPDH、ΔCTEphA2=CtEphA2-Ctβ-actin計(jì)算出各樣本組織中RON及EphA2 mRNA相對(duì)表達(dá)定量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)表示，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RON及EphA2 mRNA在膀胱腫瘤組織中的表達(dá)

在膀胱腫瘤組織及正常膀胱組織中均可檢測(cè)到RON mRNA及EphA2 mRNA的表達(dá)。RON mRNA在TCCB、IPB、PUNLMP組織中相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而其在TCCB、IPB、PUNLMP組織中相對(duì)表達(dá)量雖略有差異，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)意義（P>0.05）；EphA2 mRNA在TCCB、IPB、PUNLMP組織中相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而其在TCCB、IPB、PUNLMP組織中相對(duì)表達(dá)量雖略有差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

2.2 RON及EphA2 mRNA在TCCB組織中的表達(dá)

隨TCCB病理分級(jí)升高（即分化程度降低），RON mRNA表達(dá)水平升高，不同分級(jí)組織RON mRNA相對(duì)表達(dá)定量差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；隨TCCB臨床分期升高，RON mRNA表達(dá)水平升高，不同臨床分期組織RON mRNA相對(duì)表達(dá)定量差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；隨TCCB病理分級(jí)升高（即分化程度降低），EphA2 mRNA表達(dá)水平升高，不同分級(jí)組織EphA2 mRNA相對(duì)表達(dá)定量差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；隨TCCB臨床分期升高，EphA2 mRNA表達(dá)水平升高，不同臨床分期組織EphA2 mRNA相對(duì)表達(dá)定量差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

2.3 RON及EphA2 mRNA與TCCB病理分級(jí)及臨床分期相關(guān)性

Spearman等級(jí)相關(guān)分析表明RON mRNA表達(dá)水平與TCCB病理分級(jí)及臨床分期呈正相關(guān)，EphA2 mRNA表達(dá)水平亦與TCCB病理分級(jí)及臨床分期呈正相關(guān)，見(jiàn)表3。

表3 RON及EphA2 mRNA與TCCB病理分級(jí)及臨床分期相關(guān)性分析

3 討論

膀胱腫瘤是泌尿系常見(jiàn)病之一，發(fā)病率高、惡心率高、死亡率高。近年來(lái)，膀胱腫瘤發(fā)病率逐年升高，位居我國(guó)男性泌尿系統(tǒng)腫瘤首位[8-10]。約95%膀胱腫瘤來(lái)源于膀胱上皮，其余部分來(lái)源于間葉組織，其中絕大部分腫瘤性質(zhì)為惡性，以TCCB為主，只有少數(shù)部分性質(zhì)為良性，IPB即為一種少見(jiàn)良性腫瘤，發(fā)病率約占膀胱腫瘤的6%，部分IPB可伴發(fā)或轉(zhuǎn)化為TCCB。PUNLMP是一種介于良惡性腫瘤間的尿路上皮腫瘤，具有低度惡性潛能[8]。膀胱惡性腫瘤是一種病因、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的多階段、多步驟疾病，臨床治療效果較差，其發(fā)病機(jī)制的研究則成為膀胱腫瘤治療的關(guān)鍵。

RON為MET原癌基因之一，屬酪氨酸激酶受體，亦是一種癌蛋白，其在人體上皮性腫瘤中研究較多，發(fā)現(xiàn)RON在皮膚、大腸、乳腺、胃、卵巢腫瘤中表達(dá)水平高，顯示RON與上皮性腫瘤發(fā)生發(fā)展可能存在一定的關(guān)系[11，12]。然而，目前RON在膀胱腫瘤中研究較少。在本研究中，RON mRNA在膀胱腫瘤組織及正常膀胱組織中均可表達(dá)，而在TCCB、IPB、PUNLMP組織中相對(duì)表達(dá)量均明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明RON可能在腫瘤早期發(fā)揮一定作用。而其在TCCB、IPB、PUNLMP組織中相對(duì)表達(dá)量雖略有差異，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），我們推測(cè)RON可能并未表達(dá)在IPB細(xì)胞膜上，進(jìn)而未激活致癌作用。此外，本研究中RON mRNA表達(dá)水平隨TCCB病理分級(jí)和臨床分期升高而升高，其與TCCB病理分級(jí)及臨床分期呈正相關(guān)，說(shuō)明RON表達(dá)水平可能與TCCB浸潤(rùn)能力及分化程度存在一定聯(lián)系，與Cheng等[13]研究結(jié)論相符。

EphA2亦是一種受體酪氨酸激酶，可參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、血管形成、神經(jīng)傳導(dǎo)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞生存等生物學(xué)行為，可低水平表達(dá)于人體正常上皮細(xì)胞中[14]。在前列腺癌、乳腺癌等研究中發(fā)現(xiàn)EphA2處于高表達(dá)狀態(tài)且可促進(jìn)腫瘤惡性發(fā)展[15]。EphA2在膀胱腫瘤中的研究亦較少。本研究中，EphA2 mRNA在膀胱腫瘤組織及正常膀胱組織中均可表達(dá)，而在TCCB、IPB、PUNLMP組織中相對(duì)表達(dá)量均明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明EphA2可能在腫瘤早期發(fā)揮一定作用。EphA2 mRNA在IPB中高表達(dá)水平與TCCB、PUNLMP中表達(dá)水平差異不明顯（P>0.05），EphA2 mRNA表達(dá)水平隨TCCB病理分級(jí)和臨床分期升高而升高，其與TCCB病理分級(jí)及臨床分期呈正相關(guān)，說(shuō)明EphA2表達(dá)水平可能與TCCB浸潤(rùn)能力及分化程度存在一定聯(lián)系，其高表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)IPB惡性發(fā)展，結(jié)果與Pratt等[15]研究結(jié)論相符。

綜上所述，RON及EphA2可高表達(dá)于膀胱腫瘤組織中，在TCCB中其表達(dá)水平與病理分級(jí)及臨床分期呈正相關(guān)性，兩者可能與TCCB的發(fā)生發(fā)展具有一定關(guān)系，亦可能促進(jìn)腫瘤性發(fā)展。今后應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)RON及EphA2傳導(dǎo)及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究，為膀胱腫瘤發(fā)生發(fā)展研究更多有意義的靶點(diǎn)，為膀胱腫瘤的防治措施提供新的突破可能。

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（收稿日期：2015-01-26）