細(xì)胞自噬在原發(fā)性肝癌發(fā)生與防治中的生物學(xué)作用

朱朋飛??秦建民

[摘要] 肝細(xì)胞癌是臨床常見惡性腫瘤之一，早期診斷困難，手術(shù)切除率低，術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移率高，目前尚無治療肝癌及其復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的特異方法。細(xì)胞自噬是一種細(xì)胞自我消化過程，在能量缺乏、外界刺激等壓力下，機(jī)體將細(xì)胞內(nèi)變性、損傷、衰老或非功能性的蛋白、細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)包裹、消化，降解成為核苷、氨基酸和脂肪酸循環(huán)利用，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身代謝需要和細(xì)胞器的更新，對于細(xì)胞生存、分化以及自身穩(wěn)態(tài)的維持具有重要的生物學(xué)作用。肝癌細(xì)胞依靠細(xì)胞自噬作用維持生存和生物學(xué)活性，細(xì)胞自噬對肝細(xì)胞癌產(chǎn)生“保護(hù)”或“殺傷”不同作用，深入研究細(xì)胞自噬在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中出現(xiàn)的雙重調(diào)控作用，對于揭示肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制和防治具有重要的生物學(xué)意義。

[關(guān)鍵詞] 肝細(xì)胞癌；自噬；機(jī)制

[中圖分類號] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）04-24-05

肝細(xì)胞癌 （hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見、難治療的惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)肝癌約75萬人，而我國作為原發(fā)性肝癌的高發(fā)區(qū)，占據(jù)了一半以上，并且隨著人們生活習(xí)慣與環(huán)境改變的影響逐年增高[1]。肝癌在我國惡性腫瘤中居第六位，病死率在所有腫瘤中居第三位，僅次于肺癌和胃癌，每年我國約有13萬人死于肝癌[2]。目前對于肝癌的治療仍是以手術(shù)為主，放療、化療、消融、免疫和分子靶向藥物等治療為輔，由于肝癌起病隱匿、早期癥狀不明顯，導(dǎo)致早期診斷率低，多數(shù)患者就診時已屬中晚期，治愈率低。對于手術(shù)治療的肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，放療、化療、免疫、分子靶向藥物

等治療僅能使部分患者獲得較滿意的療效，目前尚無特異的治療方法用于肝癌及其復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的治療，因此深入揭示肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的確切機(jī)制，是降低肝癌發(fā)生率和提高治療效果的關(guān)鍵所在。

細(xì)胞自噬（autophagy）廣泛存在于真核生物中，是一種細(xì)胞自我消化過程，在能量缺乏、外界刺激等壓力下，通過自噬作用，機(jī)體將細(xì)胞內(nèi)變性、損傷、衰老或非功能性的蛋白、細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)包裹、消化，降解成為核苷、氨基酸和脂肪酸循環(huán)利用，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身代謝需要和細(xì)胞器的更新，細(xì)胞自噬對于細(xì)胞生存、分化以及自身穩(wěn)態(tài)的維持具有重要的生物學(xué)作用[3]。細(xì)胞自噬受到相關(guān)基因的嚴(yán)格調(diào)控，無論是在生理還是病理狀態(tài)下，自噬對于細(xì)胞的作用都是巨大的，特別是在腫瘤細(xì)胞中，可以緩解腫瘤細(xì)胞增殖帶來的代謝壓力，但是過度的自噬又會引起細(xì)胞的死亡，這種死亡不同于正常的細(xì)胞凋亡，它屬于細(xì)胞自噬性死亡（Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡）[4-5]。肝癌細(xì)胞可以依靠細(xì)胞自噬作用維持生存和生物學(xué)活性，并為腫瘤的生長提供物質(zhì)和能量支持，但是細(xì)胞自噬亦可抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展，細(xì)胞自噬對肝細(xì)胞癌的作用與腫瘤生長階段、微環(huán)境、基因多態(tài)性以及其他外界刺激等多種因素相關(guān)，從而對肝細(xì)胞癌產(chǎn)生“保護(hù)”或“殺傷”不同作用。深入研究細(xì)胞自噬在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中出現(xiàn)的雙重生物學(xué)調(diào)控作用，對于揭示肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制和防治具有重要的生物學(xué)意義。

1 細(xì)胞自噬發(fā)生的分子機(jī)制

自噬發(fā)生分為三個階段：吞噬泡（phagophore）、自噬小體（autophagosome）和自噬溶酶體（autolysosome）形成。在細(xì)胞收到自噬信號的誘導(dǎo)后，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無核糖體附著區(qū)的脫落雙層膜包裹待降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，形成一個扁形杯型分隔膜，形成吞噬泡；分隔膜繼續(xù)延伸可以完全包裹待降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，形成自噬小體；然后自噬小體與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等物質(zhì)被降解為營養(yǎng)物質(zhì)。

細(xì)胞自噬發(fā)生的分子機(jī)制極其復(fù)雜，其中三個步驟最為關(guān)鍵：（1）Atg1-Atg7-Atg13蛋白復(fù)合體的形成：Atg1-Atg7-Atg13蛋白復(fù)合體是細(xì)胞開始自噬的第一步，這一過程受到雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路的調(diào)控，mTOR可以將Atg13磷酸化，從而抑制Atg1-Atg7-Atg13蛋白復(fù)合體的形成，進(jìn)而抑制自噬的發(fā)生；（2）Vps34（classⅢ PI-3 kinases）的激活：Beclin-1基因可以激活Vps34，而Vps34和它的產(chǎn)物3-磷酸磷脂酰肌醇（P13-P）有利于吞噬泡的形成；（3）泛素化修飾系統(tǒng)的形成：有兩個泛素化修飾系統(tǒng)參與了自噬小體的形成，一個是Atg12-Atg5系統(tǒng)，另一個是Atg8-PE系統(tǒng)。Atg12-Atg5系統(tǒng)中還涉及Atg7和Atg10，Atg7催化Atg12和Atg10結(jié)合，然后Atg10將Atg12傳遞給Atg5，從而使Atg12和Atg5結(jié)合，形成Atg12-Atg5復(fù)合體[6]。在Atg8-PE系統(tǒng)的形成過程中，首先是Atg8被Atg4水解，使Atg8暴露出氨基乙酸的末端，然后Atg8在Atg3和Atg3的催化作用下與PE結(jié)合，最終形成Atg8-PE系統(tǒng)[7]。細(xì)胞自噬是在多種信號通路中相關(guān)分子修飾激活相互作用過程中發(fā)生，其中任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，均影響細(xì)胞自噬發(fā)生。

2 細(xì)胞自噬的信號通路調(diào)控作用

2.1 PI3KⅢ信號通路

beclin-1基因在自噬的調(diào)控中具有重要的生物學(xué)作用，它編碼的抑癌蛋白可以與Ⅲ型磷酸肌醇三磷酸激酶（PI3KⅢ）形成復(fù)合體，當(dāng)激活PI3KⅢ后，PI3KⅢ催化底物形成3-磷酸磷脂酰肌醇（PIP），PIP可以促進(jìn)細(xì)胞自噬[7]。李子?xùn)|等[8]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞缺乏營養(yǎng)時激活PI3KⅢ，形成beclin-1/ PI3KⅢ復(fù)合體，從而調(diào)控細(xì)胞自噬。另外紫外線輻射電阻相關(guān)基因（UVRAC）、Bif-1（bax interacting factor1）、B細(xì)胞淋巴癌2基因（Bcl-2）參與細(xì)胞自噬，UVRAC與Bif-1屬于抑癌蛋白，可以激活PI3KⅢ，協(xié)同beclin-1與PI3KⅢ相互作用，從而激活自噬；而Bcl-2可以與beclin-1形成二聚體，抑制beclin-1對自噬的調(diào)節(jié)作用[9-10]。Thoresen等[11]研究發(fā)現(xiàn)3-甲基腺嘌呤（3-MA）對自噬的抑制作用是通過對PI3KⅢ激活而發(fā)揮作用。因此當(dāng)PI3KⅢ信號通路相關(guān)基因功能異常激活或抑制，通過影響PI3KⅢ復(fù)合體形成調(diào)控細(xì)胞自噬發(fā)生。

2.2 mTOR信號通路

mTOR存在兩種復(fù)合形式，分別為mTORC1、mTORC2，其中mTORC1對細(xì)胞自噬產(chǎn)生影響。Nicklin等[12]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)亮氨酸增多時，活化GTPases和MAP4K3，從而激活mTORC1促進(jìn)細(xì)胞自噬。Han等[13]研究發(fā)現(xiàn)腦組織同源類似物（Rheb）和小三磷酸鳥苷酶通過激活mTOR抑制細(xì)胞自噬，而TSC-1和TSC-2復(fù)合物抑制GTP酶和Rheb，進(jìn)而抑制mTOR活性促進(jìn)細(xì)胞自噬。另外研究顯示TSC-2分別被Akt和AMPK磷酸化，當(dāng)被Akt磷酸化時，激活mTOR抑制自噬，被AMPK磷酸化時抑制mTOR的活性而促進(jìn)細(xì)胞自噬。當(dāng)細(xì)胞缺乏能量時，ATP/AMP下降引起AMPK激活，抑制mTOR活性而促進(jìn)細(xì)胞自噬[14]。mTOR信號通路中mTOR的活性狀態(tài)在細(xì)胞自噬中具有重要的生物學(xué)作用，任何影響mTOR信號通路中mTOR的活性因素能夠調(diào)控細(xì)胞自噬。

2.3 PI3K/Akt信號通路

PI3K有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型結(jié)構(gòu)形式，與細(xì)胞自噬有關(guān)的主要是Ⅰ型PI3K和Ⅲ型PI3K，其中Ⅲ型PI3K促進(jìn)細(xì)胞自噬，而Ⅰ型PI3K抑制自噬[15]。研究發(fā)現(xiàn)p27通過激活細(xì)胞周期蛋白（CDK）活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖；而p27激活需要Akt參與，當(dāng)Akt活性降低時，影響p27激活，從而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生。在PI3K/Akt通路中，磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）通過抑制PI3K和Akt激活而促進(jìn)細(xì)胞自噬[16-17]。

3 細(xì)胞自噬在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用

自噬在腫瘤的不同時期發(fā)揮著兩種相反的作用，促進(jìn)或者抑制腫瘤的生長。在腫瘤發(fā)生的早期，自噬可以通過破壞腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞器或者大分子物質(zhì)這種方式來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，然而由于腫瘤細(xì)胞大量增殖，腫瘤細(xì)胞需要大量營養(yǎng)與氧氣的支持，此時血管尚未形成，通過自噬降解細(xì)胞器和蛋白質(zhì)為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增長，另外自噬還可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受放療或者化療損害，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[18-20]。溫瑩浩等[21]通過二乙基亞硝胺誘導(dǎo)原發(fā)性肝癌模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌組織和癌前結(jié)節(jié)自噬能力較正常肝細(xì)胞下降，正常肝細(xì)胞經(jīng)種植瘤大鼠腹水作用后自噬性蛋白降解被完全抑制，而且從肝結(jié)節(jié)和肝細(xì)胞肝癌中分離出的自噬液泡溶酶體活性較低。Ding等[22]研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin 1的表達(dá)明顯低于周圍正常組織，且Beclin 1表達(dá)水平與肝癌的惡性程度相關(guān)，在同時進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)中同樣證明了Beclin 1的表達(dá)在腫瘤細(xì)胞中明顯低于正常細(xì)胞，且與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。任寧等[23]通過體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)自噬對肝癌HepG-2 細(xì)胞增殖有抑制作用，自噬不利于肝癌HepG2 細(xì)胞成活，肝癌HepG-2 細(xì)胞自噬的發(fā)生多停留在細(xì)胞周期的G1期。因此細(xì)胞自噬對肝細(xì)胞癌的作用與腫瘤發(fā)生發(fā)展的階段、微環(huán)境、基因多態(tài)性以及其他外界刺激等多種因素相關(guān)，從面對肝癌細(xì)胞產(chǎn)生“保護(hù)”或“殺傷”的不同作用，只有針對細(xì)胞自噬在肝細(xì)胞癌不同發(fā)展階段調(diào)控關(guān)鍵分子進(jìn)行有效干預(yù)，使細(xì)胞自噬產(chǎn)生抑制肝癌細(xì)胞增殖作用，才能達(dá)到防治肝癌的效果。

4 針對細(xì)胞自噬的中西醫(yī)方法治療肝癌

4.1 西藥對肝癌細(xì)胞自噬的影響

在缺乏營養(yǎng)及氧氣時，肝癌細(xì)胞依賴細(xì)胞自噬獲得營養(yǎng)，同時主動向營養(yǎng)豐富的地方遷移，抑制細(xì)胞自噬不僅減少細(xì)胞自噬對肝癌的保護(hù)作用，而且抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移[24-25]。精氨酸是肝癌細(xì)胞增殖必需的氨基酸，但肝癌細(xì)胞不能自我合成，必須從外界攝取。Glazer等[26]應(yīng)用聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞胺酶（ADI-PEG20）分解環(huán)境中的精氨酸，營造精氨酸缺乏的環(huán)境，能夠促進(jìn)細(xì)胞自噬，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞死亡。孫廣濤等[27]應(yīng)用索拉菲尼作用于肝癌細(xì)胞HepG2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同水平的自噬對肝癌細(xì)胞作用不同，基礎(chǔ)水平的自噬對肝癌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，而過量的自噬表達(dá)促使肝癌細(xì)胞死亡。李媛媛等[28]應(yīng)用奧沙利鉑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2自噬功能，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬體形成增加，而且不同靶點(diǎn)的自噬抑制劑（3-甲基腺嘌呤或氯喹）均明顯增加奧沙利鉑對肝癌細(xì)胞的生長抑制作用，增強(qiáng)奧沙利鉑對肝癌細(xì)胞的殺傷作用。杜鵬等[29]通過雷帕霉素阻斷雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞自噬發(fā)生，聯(lián)合表阿霉素時能增加自噬水平，提高HepG2細(xì)胞對化療敏感性。Zhang等[30]研究發(fā)現(xiàn)SB203580通過誘導(dǎo)AMPK和P53磷酸化，抑制DAPK磷酸化，激活A(yù)MPK和DAPK信號通路，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬，抑制肝癌細(xì)胞增殖。杜海磊等[31]研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2產(chǎn)生細(xì)胞自噬及活性氧（ROS），導(dǎo)致自噬相關(guān)基因Beclin-1 mRNA和蛋白水平表達(dá)增加，抑制ROS的產(chǎn)生能夠減少索拉非尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2自噬的表達(dá)量，表明抑制自噬增強(qiáng)了索拉非尼對肝癌細(xì)胞的抑制作用，索拉非尼在抑制肝癌細(xì)胞自噬過程中自噬可能起到保護(hù)作用。范文潔等[32]研究發(fā)現(xiàn)褪黑素（MT）在殺傷肝癌細(xì)胞時，同時激活細(xì)胞自噬保護(hù)肝癌細(xì)胞，用3-甲基腺嘌呤或氯喹抑制細(xì)胞自噬后，MT對肝癌細(xì)胞的殺傷作用明顯增強(qiáng)，表明聯(lián)用自噬抑制劑抑制細(xì)胞自噬能夠增強(qiáng)MT對肝癌細(xì)胞的治療作用。

4.2 中醫(yī)藥對肝癌細(xì)胞自噬的影響

近年來研究發(fā)現(xiàn)許多中藥單體或復(fù)方制劑通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬，抑制肝癌細(xì)胞增殖，改善肝癌患者預(yù)后。如珊瑚內(nèi)分離出的倍半萜類化合物Hirsutanol A，Hirsutanol A通過提高ROS，誘發(fā)肝癌細(xì)胞自噬，苦參堿在細(xì)胞周期G1期誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖[33-34]。王威等[35]研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽原花青素不僅可以抑制肝癌細(xì)胞增殖，而且隨原花青素濃度增加，肝癌細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)增加，表明原花青素通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬抑制肝癌細(xì)胞增殖。朱茉莉等[36]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能明顯抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的生長，并誘導(dǎo)其發(fā)生自噬，自噬激活能降低槲皮素對SMMC-7721細(xì)胞的毒性，自噬的發(fā)生與溶酶體酶組織蛋白酶B表達(dá)增強(qiáng)相關(guān)。朱傳升等[37]體外應(yīng)用三氧化二砷作用于人HepG-2肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)三氧化二砷可誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞自噬，自噬和凋亡同時存在抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞自噬的機(jī)制可能與下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)有關(guān)。張武德等[38] 應(yīng)用扶正抑瘤湯作用肝癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)其可以激活肝癌HepG-2細(xì)胞Beclin1、Bnip3、LC3表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬，抑制肝癌細(xì)胞增殖。丁向萍等[39]應(yīng)用復(fù)方蟲草作用于人肝癌HepG-2細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此復(fù)方制劑抑制肝癌細(xì)胞增殖作用主要是通過細(xì)胞自噬，導(dǎo)致細(xì)胞漿空泡變性，胞漿內(nèi)容物降解，輕度的染色質(zhì)濃縮，明顯改變細(xì)胞周期，阻滯細(xì)胞于S期，細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻，膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其誘導(dǎo)細(xì)胞自噬作用機(jī)制主要與抑制端粒酶活性、下調(diào)Survivin、NF-κB、p65及bcl-2蛋白的表達(dá)有關(guān)。細(xì)胞自噬在中醫(yī)藥抗肝癌治療中具有重要的生物學(xué)作用，通過深入研發(fā)中藥單體針對性地影響細(xì)胞自噬，能夠極大地提高藥物治療肝癌的療效。

細(xì)胞自噬在肝癌發(fā)生、發(fā)展與治療中具有重要的生物學(xué)作用，細(xì)胞自噬在肝癌不同發(fā)展階段可使腫瘤細(xì)胞自噬性死亡，抑制腫瘤的生長；自噬亦可以吞噬破壞細(xì)胞器、蛋白，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞抵抗惡劣環(huán)境的能力，保護(hù)腫瘤細(xì)胞。自噬對肝癌具有保護(hù)或抑制雙重作用，但其作用機(jī)制尚未完全闡明，相信不久的將來，隨著進(jìn)一步深入研究，闡明自噬發(fā)生的調(diào)控機(jī)制，針對關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)，不僅能夠控制肝癌發(fā)生、發(fā)展，而且減少腫瘤對抗癌藥物的耐藥性，研發(fā)針對自噬治療肝癌的靶向藥物，造福于廣大的肝癌患者。

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（收稿日期：2014-10-24